书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ６ ８ ４—２ ０ １ ６ 进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犅 狌 狉 犽 犺 狅 犾 犱 犲 狉 犻 犪犮 犲 狆犪 犮 犻 犪犻 狀犮 狅 狊 犿 犲 狋 犻 犮 狊犳 狅 狉 犻 犿 狆狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆狅 狉 狋 ２ ０ １ ６１ ２１ ２发布 ２ ０ １ ７０ ７０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准主要起草单位 ：中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、完美（中国）有限公司 。本标准主要起草人 ：赵晗、崔淑华、孙军、郝莹、田国宁、吴兴海、高业成、贾俊涛、段效辉、李建军。 Ⅰ犛 犖／犜４ ６ ８ ４—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法 １　范围 本标准规定了进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的检测方法 。本标准适用于进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的定性检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ７ ９ １ ８． １ 　化妆品微生物标准检验方法 　总则 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 　实验室　生物安全通用要求 ３　设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外 ，其他设备和材料如下 。 ３．１　恒温培养箱 ：３ ０℃±１℃ 、３ ２℃±１℃ 、３ ６℃±１℃ 。 ３．２　均质器。 ３．３　振荡器。 ３．４　光学显微镜 。 ３．５　天平：感量０． １ｇ。 ３．６　无菌移液管 ：１ｍＬ，１ ０ｍＬ（具０． １ｍＬ 刻度）或微量移液器及吸头 。 ３．７　无菌培养皿 ：直径９ ０ｍｍ（或其他商业用一次性无菌平皿 ） 。 ３．８　接种环：３ｍｍ直径。 ３．９　均质袋或均质瓶 。 ３．１ ０　全自动微生物生化鉴定系统 。 ４　培养基和试剂 ４．１　含多粘菌素 Ｂ的Ｓ Ｃ Ｄ Ｌ Ｐ 增菌液：见Ａ． １。 ４．２　含庆大霉素的 Ｂ Ｃ Ｓ Ａ增菌液：见Ａ． ２。 ４．３　含多粘菌素 Ｂ、庆大霉素的 Ｂ Ｃ Ｓ Ａ琼脂：见Ａ． ３。 ４．４　含多粘菌素 Ｂ、庆大霉素的麦康凯琼脂 （不含结晶紫 ） ：见Ａ． ４。 ４．５　革兰氏染液 ：见Ａ． ５。 ４．６　氧化酶试验试剂 ：见Ａ． ６。 ４．７　葡萄糖氧化 ／发酵管：见Ａ． ７。 ４．８　蔗糖氧化培养基 ：见Ａ． ８。 ４．９　西蒙氏枸橼酸盐培养基 ：见Ａ． ９。 １犛 犖／犜４ ６ ８ ４—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．１ ０　七叶苷培养基 ：见Ａ． １ ０。 ４．１ １　生化鉴定试剂盒 。 ５　检验程序 洋葱伯克霍尔德菌检验程序见图 １。 图１　洋葱伯克霍尔德菌检验程序 ６　操作步骤 ６．１　增菌培养 按照Ｇ Ｂ７ ９ １ ８． １ 方法制备 １∶１ ０化妆品稀释液 ，取稀释液 １ ０ｍＬ加到９ ０ｍＬ含多粘菌素 Ｂ的 Ｓ Ｃ Ｄ Ｌ Ｐ 增菌液中 ，于３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ，移取１ｍＬ，转种于１ ０ｍＬ含庆大霉素的 Ｂ Ｃ Ｓ Ａ增菌液内 ，于３ ６℃±１℃ 培养１ ８ｈ～２ ４ｈ。 ６．２　分离培养 分别用接种环取 Ｂ Ｃ Ｓ Ａ增菌液一环 ，划线接种于 Ｂ Ｃ Ｓ Ａ琼脂（含多粘菌素 Ｂ、庆大霉素 ）平板和麦康 ２犛 犖／犜４ ６ ８ ４—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.凯琼脂（含多粘菌素 Ｂ、庆大霉素 ）平板，于３ ２℃±１℃ 培养４ ８ｈ，观察各个平板上生长的菌落 。典型菌落在Ｂ Ｃ Ｓ Ａ琼脂平板上为红色圆形菌落 ，表面光滑 ，周围培养基变红 ；典型菌落在麦康凯琼脂平板上为浅黄褐色圆形菌落 ，表面光滑 ，周围培养基不变色 。 ６．３　鉴定 ６．３．１　初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取 ５个以上典型或可疑菌落 ，同一菌株接种于 ２支葡萄糖氧化 ／发酵管，其中一支加灭菌液体石蜡封口 ，另一支不封口 ，于３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ，二者均变黄为葡萄糖发酵型，未加石蜡管变黄而加石蜡管不变色为葡萄糖氧化型 。同时在营养琼脂平板上划线纯化 ，于３ ６℃±１℃培养２ ４ｈ。选择葡萄糖氧化型 （加石蜡管不变黄 ，不加石蜡管变黄 ）的纯培养物继续进行鉴定 。 ６．３．２　革兰氏染色 挑取可疑菌落涂片 ，进行革兰氏染色 。显微镜下观察 ，洋葱伯克霍尔德菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌。 ６．３．３　氧化酶试验 用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落 ，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上 。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓型氧化酶阳性 （紫红色、紫色或深蓝色 ） ，反应时间约为 ２ｍ ｉ ｎ～１ ０ｍ ｉ ｎ。 注：实验中切勿使用镍 ／铬材料。 ６．３．４　过氧化氢酶试验 用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落 ，置于洁净试管内 ，滴加３％过氧化氢溶液 （临用时配制）２ｍＬ，观察气泡产生情况 。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓产气 ，１ｓ后缓慢出现气泡 。 ６．３．５　蔗糖氧化 挑取可疑菌落接种于蔗糖氧化培养基 ，３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ，培养基变黄色为阳性 ，蓝色为阴性 。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应 。 ６．３．６　枸橼酸盐利用 挑取可疑菌落接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基 ，３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ，培养基变蓝色为阳性 ，浅绿色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应 。 ６．３．７　七叶苷利用 挑取可疑菌落接种于七叶苷培养基 ，３ ０℃±１℃ 培养２ ４ｈ，培养基变黑色为阳性 ，不变色为阴性 。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应 。 ６．３．８　替代试验 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统 ，根据６． ３． １的初步判断结果 ，对可疑菌落进行鉴定。 ７　结果报告 综合以上试验结果 ，报告１ ０ｇ（ｍＬ）样品中检出或未检出洋葱伯克霍尔德菌 。 ３犛 犖／犜４ ６ ８ ４—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.８　废弃物处理 检测过程中的废弃物按照 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 的相关要求进行处理 。 ４犛 犖／犜４ ６ ８ ４—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犃（规范性附录 ） 培养基和试剂 犃．１　含多粘菌素 犅的犛 犆 犇 犔 犘 增菌液 犃．１．１　成分 酪蛋白胨 　　　　　　　　　　　　　　　　　 １ ７ｇ大豆蛋白胨 　　　　　 ３ｇ氯化钠　　　　　　 ５ｇ磷酸氢二钾 　　　　 ２． ５ｇ葡萄糖　　　　　　 ２． ５ｇ卵磷脂　　　　　　 １ｇ吐温８ ０　　　　　　 ７ｇ蒸馏水　　　　　　　　　　　　　 １０ ０ ０ｍＬ 犃．１．２　制法 将上述成分混合后 ，加热溶解 ，调ｐＨ为７． ２±０． １ 分装，１ ２ １℃高压灭菌 ２ ０ｍ ｉ ｎ，备用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素 Ｂ，使其终浓度为 ２ ５ ００ ０ ０Ｕ ／Ｌ。 犃．２　含庆大霉素的 犅 犆 犛 犃增菌液 犃．２．１　成分 酪蛋白胨 　　　　　　　　　　　　　 １ ０ｇ酵母提取物 　　　　　　　　　　　 １． ５ｇ氯化钠　　　　　　　　　　　　　　 ５ｇ蔗糖　　　　　　　　　　　　　　　 １ ０ｇ乳糖　　　　　　　　　　　　　　　 １ ０ｇ酚红　　　　　　　　　　　　　　 ０． ０ ８ｇ结晶紫　　　　　　　　　　　　 ０． ０ ０ ２ｇ蒸馏水　　　　　　　　　　　　 １０ ０ ０ｍＬ 犃．２．２　制法 将上述成分混合后 ，加热溶解 ，调ｐＨ为７． ０±０． ２ 分装，１ １ ５℃高压灭菌 １ ５ｍ ｉ ｎ，备用。使用前，用过滤除菌方法加入庆大霉素 ，使其终浓度为 １ ０ｍｇ／Ｌ。 犃．３　含多粘菌素 犅、庆大霉素的 犅 犆 犛 犃琼脂 犃．３．１　成分 酪蛋白胨 　　　　　　　　　　　　　 １ ０ｇ ５犛 犖／犜４ ６ ８ ４—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.酵母提取物 　　　　　　　　　　　 １． ５ｇ氯化钠　　　　　　　　　　　　　　 ５ｇ蔗糖　　　　　　　　　　　　　　　 １ ０ｇ乳糖　　　　　　　　　　　　　　　 １ ０ｇ酚红　　　　　　　　　　　　　　 ０． ０ ８ｇ结晶紫　　　　　　　　　　　　 ０． ０ ０ ２ｇ琼脂　　　　　　　　　　　　　　　 １ ４ｇ蒸馏水　　　　　　　　　　　　 １０ ０ ０ｍＬ 犃．３．２　制法 将上述成分混合后 ，加热溶解 ，调ｐＨ为７． ０±０． ２ 分装，１ １ ５℃高压灭菌 １ ５ｍ ｉ ｎ，备用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素 Ｂ和庆大霉素 ，使其终浓度分别为 ６ ０ ００ ０ ０Ｕ ／Ｌ、１ ０ｍｇ／Ｌ，培养基混匀后倾注平皿 。 犃．４　含多粘菌素 犅、庆大霉素的麦康凯琼脂 犃．４．１　成分 蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　 ２ ０ｇ乳糖　　　　　　　　　　　　　　　 １ ０ｇ牛胆盐