SN-T 4643-2016 线虫标本采集分离保存规范

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４６４３—２０１６线虫标本采集分离保存规范犛狋犪狀犱犪狉犱狊犳狅狉狊犪犿狆犾犻狀犵，犱犲狋犲犮狋犻狀犵犪狀犱狆狉犲狊犲狉狏犻狀犵狊狆犲犮犻犿犲狀狅犳狀犲犿犪狋狅犱犲狊２０１６０８２３发布２０１７０３０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：顾建锋、陈先锋、张慧丽、何洁。 Ⅰ犛犖／犜４６４３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.线虫标本采集分离保存规范１　范围本标准规定了出入境植物检疫中线虫标本的采集、制作和保存方法。本标准适用于出入境检验检疫部门对线虫标本的采集、制作和保存工作。２　方法原理根据植物病原线虫不同的寄生方式，采集表现瘿瘤、叶斑、坏死、变色、畸形等症状的样品，或采集寄主植物的根及根围土壤或介质，用改良漏斗分离法等分离线虫，然后浸泡保存或制作成永久玻片，达到对线虫标本保存的目的。３　仪器、试剂和用具３．１　仪器体视显微镜（１０×以上，具透射光源）、恒温培养箱、移液器（２０μＬ～２００μＬ）、离心机（２０００ｒ／ｍｉｎ以上）、冷藏箱、天平、Ｆｅｎｗｉｃｋ漂浮器等。３．２　试剂福尔马林（４％甲醛）、甘油、乙醇、蔗糖、封片剂（中性树胶、阿拉伯树胶、指甲油）、石蜡、溶液Ⅰ（９６％乙醇／甘油／蒸馏水体积比２０∶１∶７９）、溶液Ⅱ（甘油／９６％乙醇体积比１∶１９）、乙二胺四乙酸二钠、二甲基亚砜、氯化钠、氢氧化钠。ＤＥＳＳ溶液配制方法参见附录Ａ。３．３　用具钟面皿或培养皿、细胞培养皿、盖玻片、载玻片、剪刀、线虫挑针、酒精灯、双层纸巾、线虫滤纸、纱布、５００μＬ微量离心管、密闭塑料盒、漏斗、漏斗架、乳胶管、止水夹、加热板、筛网（１０目、６０目、３００目、４００目、５００目）、取样铲、塑料袋、水桶、记号笔等。４　样品采集４．１　病变组织或土样的采集植物病原线虫按寄生方式不同一般可分为内寄生和外寄生线虫。大多数寄生线虫危害寄主植物根和地下茎，如根结属线虫犕犲犾狅犻犱狅犵狔狀犲寄生于根内，孢囊属线虫犎犲狋犲狉狅犱犲狉犪部分外露于根部。但也有部分线虫（如粒属线虫Ａｎｇｕｉｎａ、滑刃属线虫Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ、伞滑刃属线虫犅狌狉狊犪狆犺犲犾犲狀犮犺狌狊等）危害植物地上的芽、叶片、茎杆、种子、穗部等。部分植物受线虫危害后，有时可表现瘿瘤、叶斑、坏死、变色、畸形等症状，但地上部分症状一般不显著。植物受线虫危害后，发生明显病变的部位，往往也是病原线虫存在的部位。如粒属线虫在籽粒虫瘿１犛犖／犜４６４３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.中，部分滑刃属线虫在穗部籽粒颖壳的内侧，根结属线虫和孢囊属线虫都在根部。检测茎、块茎、叶中的线虫时，要注意观察植株花、叶、芽等是否有枯死、褐色角斑、矮小、畸形等受害症状，块茎、鳞茎、球根等是否有干腐、变黑等症状。重点选取表现上述症状的花、叶、芽、块茎等植物组织。无论针对植物内寄生或外寄生线虫，应考虑把样品可能带有的土壤或介质作为取样重点。取样时应用取样铲采集根系附近的土壤、介质，并尽量多采集根系，采集深度一般为土表下１０ｃｍ～２０ｃｍ。样品的数目可考虑具体情况设置，一般每个样品重量为０．５ｋｇ左右。４．２　采集信息记录和编号对于进口样品，需记录采集时间、采集地点、采集人、寄主等信息。对于国内采集的样品，还应记录其经纬度和海拔等，必要时摄影存档。从采集的样品到最后的凭证标本、显微照片及ＤＮＡ等，均需有统一的唯一性标号相对应，可实现系统溯源。４．３　采集样品的保存采集到的组织或土样等要防止干燥，写好标签后应立即放在塑料袋中，密闭袋口，避免阳光直射，及时送实验室检测。如不能及时送检，可将样品置４℃～１０℃冷藏箱贮存。５　线虫分离５．１　直接解剖法该方法适用于分离孢囊属线虫、根结属线虫等内寄生线虫，以及粒属线虫等体型较大的线虫。其方法是洗净根或种子等表面，放在盛有适量水的玻片或培养皿中，用解剖针撕破组织表面，可见组织内的线虫，有时线虫游离到水中。用线虫挑针或移液器收集线虫或孢囊。５．２　直接浸泡法该方法适用于分离地上和地下部分的迁移性内外寄生的线虫，如茎属犇犻狋狔犾犲狀犮犺狌狊、滑刃属、穿孔属犚犪犱狅狆犺狅犾狌狊等。将病组织剪成小段或撕开，加清水，浸泡数小时后即有线虫游出，在体视显微镜下用挑针或移液器收集线虫。５．３　贝曼漏斗法该方法适合分离多数样品，但对土壤效果不佳。将１０ｃｍ～１５ｃｍ直径的漏斗固定在支架上，下端接一段硅胶管或乳胶管，管的近末端用止水夹夹紧。将待分离的样品（剪成小段的叶片、茎、芽、花或破碎的种子等）用纱布包好，轻轻放入盛有适量清水的漏斗（使样品略露出水面为宜）。２０℃～２５℃静置２４ｈ～４８ｈ，打开止水夹，用培养皿或钟面皿接取线虫液５ｍＬ～１０ｍＬ，镜检。５．４　浅盘分离法该方法系贝曼漏斗法的改进，能一次分离较多的样品，因筛网面积大，通气性好，能提高分离效率。浅盘分离法装置由两只不锈钢浅盘和双层纸巾或纱布组成，上盘为１０目的筛网，下盘为正常浅盘。分离线虫时，将双层纸巾或纱布平铺在上盘的筛网上，然后将待分离的样品（介质、土壤、及剪成小段的叶片、茎、芽、花、病残体或破碎的种子等）撒铺在表面，将筛网放在装有适量清水的底盘内（水量以刚好浸透样品为宜）。２０℃～２５℃静置２４ｈ～４８ｈ后，移去筛网，用４００目分样师收集线虫，然后将线虫液转移到培养皿或钟面皿，镜检。２犛犖／犜４６４３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．５　改良漏斗分离法改良漏斗法吸取了浅盘法和传统漏斗法各自的优点，在提高了漏斗法分离效率的同时，又解决了浅盘法必须使用套筛而使植物组织等杂物经常堵塞４００目筛的筛孔的问题，适合分离各类样品。改良漏斗分离装置由一只较大并类似于贝曼漏斗的玻璃或有机玻璃作为外壳，上部装置则与浅盘装置相似。将线虫滤纸或双层纸巾平放在筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分；将待分离线虫的样品放置其上；从筛盘下部的空隙中将水注入分离器中，以淹没供分离的材料为止；在约２０℃～２５℃下放置２４ｈ～４８ｈ后，打开止水夹，用离心管接取约５ｍＬ的水样；静置２０ｍｉｎ左右或１５００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，吸去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液。５．６　直接过筛分离法该方法可用于分离土壤中的线虫。将约５００ｇ土样置于５Ｌ水桶中，捏碎土块并用急水流冲成土壤悬浮液，静置约３０ｓ后将上清液通过６０目的分离筛将悬浮液注入第二个水桶中，再静置约３０ｓ，将土壤悬浮液再经过３００目的分样筛，收集筛子上的残留物，用漏斗法进行分离。５．７　离心漂浮分离法该方法可用于分离土壤中的线虫。将３０ｇ供试土样放在离心管内，加约１００ｍＬ水并充分小心搅匀，置于离心机内以２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去上清液，加进配好的８００ｇ／Ｌ蔗糖溶液搅匀，再次以２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，将上清液注进预先装水的烧杯里，用３００目、４００目、５００目网筛套在一起，将烧杯内的水倒入筛网，并用水冲洗，最后将三个筛网里的线虫分别洗到带平行横纹的塑料培养皿中，置于体视显微镜下观察。５．８　淘洗过筛离心分离法该方法可用于分离土壤中的线虫。称取土壤约１００ｇ，将称好的土倒入水盆中，加水搅匀，静置１ｍｉｎ。将水倒入一组网筛，即上层为６０目，下层为４００目，边倒边震荡分样筛，防止水充满下层的４００目筛而从筛中溢出。然后在盆中加入水后混匀，静置１ｍｉｎ，倒入网筛中，如此重复三次。将４００目的分样筛取下，用喷头把４００目网筛中的线虫悬液中的泥浆冲洗干净，倒入烧杯中，静置。将静置烧杯中的上层水轻轻倒掉，只保留下层大约３０ｍＬ水、线虫和泥浆的混合物。将混合物轻轻摇匀，倒入离心管中，在天平上调平衡，把平衡后的离心管放入离心机中，第一次离心（离心机的转速２０００ｒ／ｍｉｎ，离心时间为４ｍｉｎ）。倒掉第一次离心后的离心管内的上层液，保留土层。在离