书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ６ ３ ０—２ ０ １ ６ 植物病原菌及病害标本采集保存规范 犆 狉 犻 狋 犲 狉 犻 狅 狀犳 狅 狉犮 狅 犾 犾 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱 狆狉 犲 狊 犲 狉 狏 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狆犾 犪 狀 狋狆犪 狋 犺 狅犵犲 狀 狊犪 狀 犱犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲狊 狆犲 犮 犻 犿 犲 狀 ２ ０ １ ６０ ８２ ３发布 ２ ０ １ ７０ ３０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国天津出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国山东出入境检验检疫局 。本标准主要起草人 ：刘鹏、郭京泽、张莹、胡佳续、林宇、王禹、姜一、廖芳、赵文军、封立平、黄国明。 Ⅰ犛 犖／犜４ ６ ３ ０—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.植物病原菌及病害标本采集保存规范 １　范围 本标准规定了植物病原菌及病害标本的采集 、保存和记录方面的要求和规范 。 本标准适用于植物和植物产品中植物病原菌及病害标本的采集和保存 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ５ ８ ９　植物病原真菌检测规范 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ６ ０ １　植物病原细菌常规检测规范 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ６ ８ ２　植物有害生物信息采集要求 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ９ ６ ４　植物病毒检测规范 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ６ ８ ９　植物检疫性有害生物实验室生物安全操作规范 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３．１ 植物病原菌 　狆犾 犪 狀 狋狆犪 狋 犺 狅犵犲 狀能侵染寄生于植物体并导致侵染性病害发生的生物 。本标准中植物病原菌的定义包括有植物病原 真菌、细菌、病毒、类病毒和植原体 。 ３．２ 病害标本 　犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲狊 狆犲 犮 犻 犿 犲 狀本标准中特指带有症状的植株或植物组织 。 ４　基本原则 植物病原菌及病害标本的采集和保存应用于病害识别 、检测和鉴定依据及科研工作中 ，保存的菌种 和标本须满足以上的工作要求 。 ５　器具和试剂 ５．１　仪器和工具 常用的工具有刀 、剪、锄、锯等，以及标本夹 、标本箱、标本纸、小玻瓶、塑料袋、标签、便携保温箱等 。 分离纯化病原菌需要的工具和仪器有酒精灯 、接种针、手术刀、镊子、玻片、超净台、显微镜、灭菌锅等 。 １犛 犖／犜４ ６ ３ ０—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.植物病原菌保存常用到玻璃试管 、安瓿瓶、冰箱、培养箱、冷冻干燥机等 。 ５．２　试剂 标本保存会用到多种浸渍液 ，其用途是保持植物标本的稳定性 ，例如防腐浸渍液等 。用于菌种和核 酸保存的保护剂和缓冲液 ，例如甘油缓冲液 、矿物油、二甲基亚砜 （ＤＭＳ Ｏ） 、奶粉溶液 、Ｔ Ｅ缓冲液等 。 常用试剂见附录 Ａ。 ６　植物病原菌及病害标本的采集和制作 ６．１　准备 对于植物病原菌及病害标本的采集需要了解待研究病害的发生发展规律 、症状特征 ，选择合适的季 节、时间以及植株部位 ，选用合适的工具 。 ６．２　症状观察 根据具体病害的症状特征 ，选取典型症状的发病植株部位和病原菌存活部位进行采集 。 ６．３　病害标本的采集 选用合适的工具对带有症状的植株或植物组织进行取样 ，对于病害症状标本要尽量保持原有性状 ， 用于分离纯化的样品要保证病原菌能够得到有效分离 ，例如在采集过程中携带保温箱 ，可将采集样品及 时放置于低温条件以免性状发生变化 。注意避免采集的样品之间交叉污染 ，以及在储存和运输过程中 保证样品的密封 ，防止污染和扩散 。 ６．４　病害标本的制作 采集的标本通过鉴定后 ，除作为分离用组织材料外 ，一般采用干燥法和浸渍法进行保存 ，要求能够 尽量保持标本的本来性状 。干燥法是指用吸水纸 、脱脂棉等吸取植物组织水分 ，压制成干燥的标本并保 存，对于水分多和较大的标本一般采用冷冻干燥或烘箱脱水等方法 ；浸渍法是指用具有防腐和保持标本 色泽的浸渍液对标本进行浸泡保存的方法 。 ６．５　记录 依据Ｓ Ｎ／Ｔ２ ６ ８ ２要求，对于采集的标本要及时记录信息 ，主要包括寄主名称 、时间和地点 、主要发 生情况、生态环境因子等 。典型病害症状其性状容易发生变化的标本要保存照片资料 。信息记录表格 见附录Ｂ。 ６．６　病害标本的保存 植物病害标本一般放置于干燥 、避光的室温环境 ，每３个月～６个月进行定期检查 ，干燥法制作的 标本主要防止发霉和虫蛀 ，可定期更换吸水纸等干燥材料并使用除虫药剂 。浸渍法制作的标本要注意 避光或在暗处保存 ，以延缓浸渍液的氧化 ，增加保存时间 ，同时定期检查标本瓶的密封情况 。 ６．７　病原菌的分离纯化和鉴定 植物病原真菌和细菌的分离纯化要注意的方面包括实验环境条件 、材料选择 、表面消毒 、分离方法 ２犛 犖／犜４ ６ ３ ０—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.和转接纯化 。应依据Ｓ Ｎ／Ｔ２ ５ ８ ９、Ｓ Ｎ／Ｔ２ ６ ０ １和Ｓ Ｎ／Ｔ２ ９ ６ ４等技术标准对采集的病原菌标本进行分离 纯化和鉴定 ，对于不能及时分离的标本样品要低温冷藏 ，应尽快进行病原菌的分离纯化 。病原菌的鉴定 方法若无标准可循 ，应在科赫法则指导下完成鉴定工作 。 ７　植物病原菌的保存 ７．１　真菌菌种的保存方法 ７．１．１　定期移植 又称传代培养保藏法 ，包括斜面培养 、穿刺培养 、液体培养等 。将菌种接种于适宜的培养基中 ，最适 条件下培养 ，待生长充分后 ，于４℃～８℃进行保存并间隔一定时间 （６个月～８个月）进行移植培养 。 常用培养基见附录 Ａ。 ７．１．２　矿物油保存 将菌种接种在适宜的斜面培养基上 ，在最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的矿物油 ， 使其覆盖整个斜面 ，加的量应该超过斜面顶部 １ｃ ｍ，室温或冷藏保存 。该方法在真菌菌种保藏中应用 广泛，多数真菌可以用这种方法保存 ，一般能够存活 ３年以上，有的存活期可达 １ ０年。 ７．１．３　土壤保存 十壤保存法一般用于产生孢子的真菌 ，有两种不同的方法 。一种方法是将孢子悬浮液加在试管中 灭菌的土壤中 ，任其干燥后保存 ，或将干的真菌孢子与试管中灭菌的干土壤混合后保存 。另一种方法是 试管中放 ５ｇ含水量７ ０％的土壤，灭菌后加 １ｍＬ的孢子悬浮液 ，在室温下培养 １ ０天后保存 。土壤保 存的菌种 ，一般都是放在冰箱 ４℃～６℃冷藏。 ７．１．４　干燥保存 干燥以后的真菌孢子或菌丝体 ，与干燥的砂 、土壤或硅胶等混合 ，也可将纯培养菌丝放置于灭菌滤 纸上，抽真空后密封室温或低温保存 。该方法在真菌菌种的短期保存中经常采用 ，一般能保存 ２年 以上。 ７．１．５　冻干保存 该方法适用于能够产生孢子的真菌 ，将孢子悬浮液少许放置于安瓿瓶中冷冻后在低温环境下抽真 空，抽气使冷冻状态的悬浮液完全干燥后 ，安瓿瓶封口后在室温下或冷藏保存 ，该方法一般能保存 ３年 以上。 ７．１．６　灭菌蒸馏水中保存 将保存的真菌先在琼脂培养基平皿上培养 ，然后切取小块琼脂培养基 ，放在灭菌的蒸馏水中保存 。 灭菌的蒸馏水可以盛在有螺盖的小玻瓶中或者用橡皮塞密封的试管中室温或低温保存 。该方法常用于 真菌菌种的短期保存 ，一般能保存 １年以上。 ７．１．７　－８ ０℃超低温保存 将真菌孢子悬浮液或菌丝培养物置于 －８ ０℃超低温冰箱中保存 。注意在保存准备时需要添加合 ３犛 犖／犜４ ６ ３ ０—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.适的保护剂 ，一般能够保存 ２年以上。保护剂常用灭菌甘油 ，浓度一般为 ３ ０％～５ ０％。 ７．１．８　液氮保存 将干燥的真菌孢子或菌丝体 ，或者加有保护剂的菌体培养物放置于无菌安瓿瓶中 ，经过预冻至 －４ ０℃，然后立即放入液氮生物贮存罐中保存 。该方法常用于真菌菌种的长期保存 ，一般能保存 ３年 以上。 ７．１．９　核酸保存 将分离纯化的真菌菌种提取核酸 ，提取方法可参照相关技术资料 ，也可采用商品试剂盒 。提取的核 酸可以放置于 Ｔ Ｅ缓冲液中冷藏保存 ，或分装后 －２ ０℃保存，注意避免反复冻融 ，一般能够保存 １年以 上。需要长期保存的可以干燥处理后超低温保存 。 ７．２　细菌菌种的保存方法 ７．２．１　植物组织保存 某些细菌可以在干燥的植物组织上常温保存 ，如叶斑病可以保存干燥的叶片 。对于根、茎等组织 ， 可以放在塑料袋内 ，在－２ ０℃下保存。 植物组织中保存也能应用于植原体等不能培养的病原菌 ，采用组培或定期接种 ，维持病株的办法 。 ７．２．２　斜面冷藏保存 斜面保存方法适用于短期保存 。多数细菌在斜面上不断生长 ，因此保存期不过 １周～１ ０周。由于 不断生长和移植 ，致病力容易发生变化 ，斜面应放置于冰箱冷藏保存 。常用培养基见附录 Ａ。 ７．２．３　灭