SN-T 4629-2016 检疫性有害生物凭证标本核酸制备保存与管理规范

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４６２９—２０１６检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范犘狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀、狆狉犲狊犲狉狏犪狋犻狅狀犪狀犱犿犪狀犪犵犲犿犲狀狋狊狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀犳狅狉狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆犲狊狋狏狅狌犮犺犲狉狊狆犲犮犻犿犲狀狊２０１６０８２３发布２０１７０３０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：宋云、陈岩、吕继洲、赵文军、吴绍强、朱水芳。 Ⅰ犛犖／犜４６２９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范１　范围本标准规定了检疫性有害生物凭证标本核酸保存与管理的要求。本标准适用于检疫性有害生物凭证标本核酸保存与管理。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ１１９３　基因检验实验室技术要求３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１凭证标本　狏狅狌犮犺犲狉狊狆犲犮犻犿犲狀狊具有完备的采集、鉴定信息（采集人、日期、地点、生境、鉴定人、种名等），用于物种复核、引证、溯源并永久保存的标本。３．２核酸　狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱核酸分子分为两类：脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）和核糖核酸（ＲＮＡ），是细胞内携带遗传信息的物质。４　核酸的处理４．１　常用设备针对不同来源的材料和样品采用不同的处理方法，常用设备参见附录Ａ。４．２　核酸来源对于昆虫、真菌、线虫、细菌、病毒、杂草，核酸来自于有害生物个体或纯培养，病毒及植原体及难养细菌来自于染病植物材料。４．３　核酸提取４．３．１　核酸的释放４．３．１．１　机械法包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解、液氮研磨和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎。１犛犖／犜４６２９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.４．３．１．２　化学法在一定的ｐＨ环境下，加入表面活性剂或强离子剂（ＣＴＡＢ、ＳＤＳ等）使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀，核酸从细胞内释放出来。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸不降解。４．３．１．３　酶法通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶Ｋ）使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。４．３．２　核酸的分离纯化４．３．２．１　酚／氯仿抽提法细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚 ∶氯仿∶异戊醇（２５∶２４∶１）混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用７０％乙醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。４．３．２．２　固相抽提法因分离和纯化同步进行，并且有商品试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。固相抽提方法的固相支持物有硅胶、玻璃颗粒、硅藻土、磁性颗粒、阴离子交换载体等，在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到固相支持物而与其他生物分子分离。４．４　核酸的质量检测完整性检测：通过凝胶电泳检测ＤＮＡ为明亮单一的条带：ＲＮＡ为２８ｓ（２３ｓ）、１８ｓ（１６ｓ）、５．８ｓ（５ｓ）三条清晰的ｒＲＮＡ条带，且２８ｓ与１８ｓ条带亮度比值约２∶１。纯度检测：ＤＮＡ：ＯＤ２６０／ＯＤ２８０在１．７～１．９之间；ＲＮＡ：ＯＤ２６０／ＯＤ２３０在１．９～２．１之间。浓度检测：核酸浓度不少于１００ｎｇ／μＬ，体积不少于１００μＬ。符合上述要求的核酸可用于进一步保存，否则需重新提取。核酸提取过程中采取防止交叉污染措施，并符合ＳＮ／Ｔ１１９３的要求。４．５　保存４．５．１　保存管使用在－８０℃条件下专用的冻存管保存。ＲＮＡ要求离心管ＤＥＰＣ处理过。４．５．２　标签利用透明的可在－８０ ℃ 不脱落的标签，标签内容：样品编号（ＳａｍｐｌｅＩＤ），采集编号（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮｕｍｂｅｒ），科中文名（ＣｈｉｎｅｓｅＮａｍｅｏｆｆａｍｉｌｙ），科拉丁名（ＬａｔｉｎＮａｍｅｏｆＦａｍｉｌｙ），属中文名（ＣｈｉｎｅｓｅＮａｍｅｏｆＧｅｎｕｓ），种中文名（ＣｈｉｎｅｓｅＮａｍｅｏｆＳｐｅｃｉｅｓ），保存时间，含量，鉴定人，单位，联系方式。４．５．３　保存盒统一使用１００管／盒的纸盒保存，保存盒分为昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫及杂草几类，在盒子侧面贴标签，标签包含种类名称。２犛犖／犜４６２９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.４．５．４　保存条件每个样品４种保存方式：－２０℃保存；－８０℃保存；液氮保存；冻干粉状态保存；每种保存方式的样品不少于１０管。冰箱带锁并具有断电或温度异常报警功能。５　核酸的管理５．１　设备管理冰箱应有专人管理，建立使用台账，使用记录。用于保存核酸样品的冰箱等设备需要定期进行计量校验；每天检查冰箱温度并做登记记录。５．２　核酸质量核查标本核酸需要定期检测与更新，每隔一年一次，随机抽取检测保存的各类有害生物的核酸样品，按ｌ％比例抽取，按照不同类型有害生物的标准化流程监控，电泳检测，检测结果符合上述保存要求，放回原处，并记录；检测结果不符合要求的，按以上的规范，重新提取、测定与保存样品。５．３　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的名称与编号、来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。检测需有最终的实验数据、电泳结果照片等。原始数据应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。６　复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要检查实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。３犛犖／犜４６２９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）核酸保存常用仪器设备研钵、超声破碎仪、匀浆机、离心管、指型管、水浴锅、可调移液器、可调移液器头、涡旋振荡器、超净工作台、电子天平、分光光度计、ＰＣＲ仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、凝胶成像系统、灭菌锅、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、低温冰箱、纯水机等。４犛犖／犜４６２９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.参　考　文　献　　［１］　ＫＩＥＦＥＲＥ，ＨＥＬＬＥＲＷ，ＥＲＮＳＴＤ．Ａｓｉｍｐｌｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃ ｔｉｏｎａｌＲＮＡｆｒｏｍｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓｒｉｃｈｉｎｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ，２０００，１８：３３  ３９．［２］　ＳＡＬＺＭＡＮＲＡ，ＦＵＪＩＴＡＴ，ＺＨＵ—ＳＡＬＺＭＡＮＫ．ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓｏｒｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅ  ｐｏｒｔｅｒ，１９９９，１７：１１  １７．５犛犖／犜４６２９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.

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