书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ６ ２ ４．６—２ ０ １ ６ 入境环保用微生物菌剂检测方法第６部分：金黄色葡萄球菌 犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊犳 狅 狉犲 狓 犪 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犻 犿 狆狅 狉 狋犿 犻 犮 狉 狅 犫 犻 犪 犾犫 犾 犲 狀 犱 狊 犻 狀狋 犺 犲犲 狀 狏 犻 狉 狅 狀 犿 犲 狀 狋 犪 犾狆狉 狅 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀 —犘 犪 狉 狋６：犛 狋 犪狆犺狔犾 狅 犮 狅 犮 犮 狌 狊犪 狌 狉 犲 狌 狊 ２ ０ １ ６０ ８２ ３发布 ２ ０ １ ７０ ３０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４《入境环保用微生物菌剂检测方法 》共分为１ ７部分： — — —第１部分：地衣芽孢杆菌 ； — — —第２部分：短小芽孢杆菌 ； — — —第３部分：巨大芽孢杆菌 ； — — —第４部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ； — — —第５部分：β型溶血性链球菌 ； — — —第６部分：金黄色葡萄球菌 ； — — —第７部分：沙门氏菌 ； — — —第８部分：志贺氏菌 ； — — —第９部分：致泻大肠埃希氏菌 ； — — —第１ ０部分：淡紫拟青霉 ； — — —第１ １部分：雅致小克银汉霉 ； — — —第１ ２部分：哈茨木霉 ； — — —第１ ３部分：黄孢原毛平革菌 ； — — —第１ ４部分：焦曲霉； — — —第１ ５部分：解淀粉芽孢杆菌 ； — — —第１ ６部分：类产碱假单胞菌 ； — — —第１ ７部分：恶臭假单胞菌 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４的第６部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 。本部分主要起草人 ：李成镛、王嫱、蒋施、刘瑜、侯彤言、付洋、王芳。 Ⅰ犛 犖／犜４ ６ ２ ４．６—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.入境环保用微生物菌剂检测方法第６部分：金黄色葡萄球菌 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４的本部分规定了入境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的形态学鉴定 、生化鉴定、普通Ｐ Ｃ Ｒ、实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ检测方法 。本部分适用于入境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的检测和鉴定 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　主要试剂和培养基 ３．１　实验用水应符合 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的规格 。 ３．２　生理盐水 ：见附录Ａ中Ａ． １。 ３．３　７． ５％氯化钠肉汤 ：见Ａ． ２。 ３．４　血琼脂平板 ：见Ａ． ３。 ３．５　Ｂ ａ ｉ ｒ ｄ  Ｐ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ 琼脂平板 ：见Ａ． ４。 ３．６　脑心浸出液肉汤 （ＢＨ Ｉ） ：见Ａ． ５。 ３．７　兔血浆：见Ａ． ６。 ３．８　革兰氏染色液 ：见Ａ． ７。 ３．９　营养琼脂小斜面 ：见Ａ． ８。 ３．１ ０　ＤＮＡ分子量标记 ：１ ０ ０ｂｐＤＮＡｌ ａ ｄ ｄ ｅ ｒ 。 ３．１ １　ｄ ＮＴ Ｐ：ｄ ＡＴ Ｐ、ｄ ＴＴ Ｐ、ｄ ＧＴ Ｐ、ｄ Ｃ Ｔ Ｐ。 ３．１ ２　Ｔ Ｂ Ｅ：见Ａ． ９。 ３．１ ３　犜 犪狇ＤＮＡ聚合酶。 ３．１ ４　细菌基因组 ＤＮＡ提取试剂盒 。 ３．１ ５　琼脂糖。 ３．１ ６　溴化乙锭 。 ４　主要仪器和设备 ４．１　电子天平 （感量０． ０ １ｇ） 。 ４．２　恒温培养箱 ：３ ６℃±１℃ 。 ４．３　恒温水浴锅 。 ４．４　台式冷冻离心机 （最高转速 １ ５０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ） 。 １犛 犖／犜４ ６ ２ ４．６—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．５　Ｐ Ｃ Ｒ扩增仪。 ４．６　实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ仪。 ４．７　微量移液器和灭菌吸头 ：１ ０μＬ、２ ０μＬ、２ ０ ０μＬ、１０ ０ ０μＬ。 ４．８　高压灭菌锅 。 ４．９　Ｐ Ｃ Ｒ超净工作台 。 ４．１ ０　电泳仪。 ４．１ １　核酸／蛋白分析仪 。 ４．１ ２　凝胶成像系统 。 ４．１ ３　无菌培养皿 ：直径９ ０ｍｍ。 ５　样品制备 以无菌操作取 １ｇ（ｍＬ）样品加入到 １ ０ ０ｍＬ 生理盐水中混匀 ，从中移取 ２ ５ｍＬ加入到２ ２ ５ｍＬ 灭 菌生理盐水中混匀 。取样过程中 ，在样品旁边放置 １个营养琼脂平板作为空白对照 。 ６　形态学及生化鉴定 ６．１　增菌 从上述样品匀液中取 ２ ５ｍＬ加入到２ ２ ５ｍＬ 的７． ５％氯化钠肉汤的均质袋中混匀 ，于３ ６℃±１℃培养１ ８ｈ～２ ４ｈ。金黄色葡萄球菌在 ７． ５％氯化钠肉汤中呈混浊生长 。将上述培养物 ，分别划线接种到 Ｂ ａ ｉ ｒ ｄ  Ｐ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ 平板和血平板 ，血平板３ ６℃±１℃ 培养１ ８ｈ～２ ４ｈ。Ｂ ａ ｉ ｒ ｄ  Ｐ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ 平板３ ６℃±１℃ 培养 １ ８ｈ～２ ４ｈ观察记录菌落特征 ，必要时可将培养时间延长至 ４ ５ｈ～４ ８ｈ。 ６．２　分离 金黄色葡萄球菌在 Ｂ ａ ｉ ｒ ｄ  Ｐ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ 平板上，菌落直径为 ２ｍｍ～３ｍｍ，颜色呈灰色到黑色 ，边缘为淡 色，周围为一混浊带 ，在其外层有一透明圈 。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度 ，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落 ，但无混浊带及透明圈 。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色淡些 ，外观可能粗糙并干燥 。在血平板上 ，形成菌落较大 ，圆形、光滑凸起 、湿润、金黄色 （有时为白色 ） ，菌落周围可见完全透明溶血圈 。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验 。 ６．３　染色、镜检 染色镜检 ：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌 ，排列呈葡萄球状 ，无芽孢，无荚膜，直径约为 ０． ５μｍ～１μｍ。 ６．４　血浆凝固酶试验 挑取Ｂ ａ ｉ ｒ ｄ  Ｐ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ 平板或血平板上可疑菌落 １个或以上 ，分别接种到 ５ｍＬＢＨ Ｉ 和营养琼脂小斜 面，３ ６℃±１℃ 培养１ ８ｈ～２ ４ｈ。取新鲜配置兔血浆 ０． ５ｍＬ，放入小试管中 ，再加入ＢＨ Ｉ培养物０． ２ｍＬ～０． ３ｍＬ，振荡摇匀 ，置于 ３ ６℃±１℃ 恒温箱或水浴箱内 ，每３ ０ｍ ｉ ｎ 观察一次 ，观察６ｈ，如呈现凝固 （即将试管倾斜或倒置时 ，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半 ，被判定为阳性结果 。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照 。也可用商品化的试剂 ，按说明书操作 ，进行血浆凝固酶试验 。结果如可疑 ，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 ５ｍＬＢＨ Ｉ ，３ ６℃±１℃ 培养１ ８ｈ～４ ８ｈ，重复试验 。 ２犛 犖／犜４ ６ ２ ４．６—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６．５　结果判定和报告 综合６． ２、６． ４的结果，报告１ｇ（ｍＬ）样品中检出 （或未检出 ）金黄色葡萄球菌 。 ７　分子生物学检测 （选做） ７．１　细菌模板 犇 犖 犃的提取 ７．１．１　直接提取法 取６． １中菌液２ｍＬ加入２ｍＬ无菌离心管中 ，１ ００ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心２ｍ ｉ ｎ，尽量弃净上清 ，沉淀加入 Ｔ Ｅ １ ０ ０μＬ、１ ０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶１ ０ ０μＬ，３ ７℃温育３ ０ｍ ｉ ｎ，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心２ｍ ｉ ｎ，沉淀加入 Ｔ Ｅ缓冲 液６ ０ ０μＬ重悬，再加入１ ５ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ ２ ５μＬ，５ ５℃温育１ｈ后沸水浴 １ ０ｍ ｉ ｎ，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心 ５ｍ ｉ ｎ，取上清于 －２ ０℃保存以待检测 。 ７．１．２　有机溶剂提取法 取６． １中菌液２ｍＬ加到２ｍＬ无菌离心管中 ，１ ００ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心２ｍ ｉ ｎ，弃上清，尽量弃净上清 ，沉 淀加入Ｔ Ｅ缓冲液５ ７ ０μＬ重悬，然后加入 １ ０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶１ ０ ０μＬ，３ ７℃温育３ ０ｍ ｉ ｎ，再加入１ ０％ Ｓ Ｄ Ｓ３ ０μＬ，６ ５℃温育１ ０ｍ ｉ ｎ，加入等体积的酚混匀 ，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｍ ｉ ｎ，取上清移入一新离心管 中，重复一次 ，两次酚抽提后取上清加等体积的酚 ／氯仿（１∶１，体积比）混匀，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｍ ｉ ｎ， 取上清再移入一新离心管中 ，加等体积的无水乙醇 ，１／１ ０体积的３ｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸钠，轻缓颠倒混匀 ， １ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｍ ｉ ｎ，弃上清，沉淀用５ ０ ０μＬ７ ５％乙醇洗两次 ，离心管开盖室温放置数分钟使乙 醇挥发，加入１ ０ ０μＬ无菌水（预先加热至 ６ ５℃有利于ＤＮＡ溶解） ，－２ ０℃保存以待检测 。 ７．１．３　试剂盒法 使用商品化的细菌基因组 ＤＮＡ提取试剂盒 ，具体提取操作参照说明书进行 。 ７．２　犇 犖 犃质量检测 将提取的 ＤＮＡ用１． ０％含溴化乙锭 （或等效染料 ）的琼脂糖凝胶进行完整性检测 。然后