书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ６ ２ ４．５—２ ０ １ ６ 入境环保用微生物菌剂检测方法第５部分：β型溶血性链球菌 犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊犳 狅 狉犲 狓 犪 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犻 犿 狆狅 狉 狋犿 犻 犮 狉 狅 犫 犻 犪 犾犫 犾 犲 狀 犱 狊 犻 狀狋 犺 犲犲 狀 狏 犻 狉 狅 狀 犿 犲 狀 狋 犪 犾 狆狉 狅 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀 —犘 犪 狉 狋５：β犛 狋 狉 犲狆狋 狅 犮 狅 犮 犮 狌 狊犺 犲 犿 狅 犾 狔狋 犻 犮 狌 狊 ２ ０ １ ６０ ８２ ３发布 ２ ０ １ ７０ ３０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４《入境环保用微生物菌剂检测方法 》共分为１ ７部分： — — —第１部分：地衣芽孢杆菌 ； — — —第２部分：短小芽孢杆菌 ； — — —第３部分：巨大芽孢杆菌 ； — — —第４部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ； — — —第５部分：β型溶血性链球菌 ； — — —第６部分：金黄色葡萄球菌 ； — — —第７部分：沙门氏菌 ； — — —第８部分：志贺氏菌 ； — — —第９部分：致泻大肠埃希氏菌 ； — — —第１ ０部分：淡紫拟青霉 ； — — —第１ １部分：雅致小克银汉霉 ； — — —第１ ２部分：哈茨木霉 ； — — —第１ ３部分：黄孢原毛平革菌 ； — — —第１ ４部分：焦曲霉； — — —第１ ５部分：解淀粉芽孢杆菌 ； — — —第１ ６部分：类产碱假单胞菌 ； — — —第１ ７部分：恶臭假单胞菌 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４的第５部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 。本部分主要起草人 ：李成镛、崔妍、赵颖、蒋施、张明、雷佳、王芳。 Ⅰ犛 犖／犜４ ６ ２ ４．５—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.入境环保用微生物菌剂检测方法第５部分：β型溶血性链球菌 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４的本部分规定了入境环保用微生物菌剂卫生学检验 β型溶血性链球菌的形态学鉴定 、生化鉴定 。本部分适用于入境环保用微生物菌剂卫生学检验 β型溶血性链球菌的检测和鉴定 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　主要试剂和培养基 ３．１　实验用水 ：应符合Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的规格 。 ３．２　生理盐水 ：见附录Ａ中Ａ． １。 ３．３　改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基 （ｍＴ Ｓ Ｂ） ：见Ａ． ２。 ３．４　哥伦比亚 ＣＮＡ血琼脂：见Ａ． ３。 ３．５　哥伦比亚血琼脂 ：见Ａ． ４。 ３．６　草酸钾血浆 ：见Ａ． ５。 ３．７　０． ２ ５％氯化钙（Ｃ ａ Ｃ ｌ ２）溶液：见Ａ． ６。 ３．８　３％过氧化氢 （Ｈ２Ｏ２）溶液：见Ａ． ７。 ３．９　生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡 。 ４　主要仪器和设备 ４．１　电子天平 ：感量０． ０ １ｇ。 ４．２　恒温培养箱 ：３ ６℃±１℃ 。 ４．３　厌氧培养装置 。 ４．４　高压灭菌锅 。 ４．５　无菌培养皿 ：直径９ ０ｍｍ。 ４．６　水浴装置 ：３ ６℃±１℃ 。 ４．７　微生物生化鉴定系统 。 ５　样品制备 以无菌操作取 １ｇ（ｍＬ）样品加入到 １ ０ ０ｍＬ 生理盐水中混匀 ，从中移取 ２ ５ｍＬ加入到２ ２ ５ｍＬ 灭 １犛 犖／犜４ ６ ２ ４．５—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.菌生理盐水中混匀 。取样过程中 ，在样品旁边放置 １个营养琼脂平板作为空白对照 。 ６　形态学及生化鉴定 ６．１　增菌 从上述样品匀液中取 ２ ５ｍＬ加入到盛有 ２ ２ ５ｍＬｍＴ Ｓ Ｂ 的均质袋中混匀 ，于３ ６ ℃±１ ℃ 培养 １ ８ｈ～２ ４ｈ。 ６．２　分离培养 将增菌液划线接种于哥伦比亚 ＣＮＡ血琼脂平板 ，３ ６ ℃±１ ℃ 厌氧培养 １ ８ｈ～２ ４ｈ，观察菌落形态。溶血链球菌在哥伦比亚 ＣＮＡ血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约 ２ｍｍ～３ｍｍ，灰白色、半透明、光滑、表面突起 、圆形、边缘整齐 ，并产生β型溶血。 ６．３　革兰氏染色 将６． ２中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色 ，镜检。 β型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性 ，呈球形或卵圆形 ，常排列成短链状 。 ６．４　生化鉴定法 ６．４．１　触酶试验 挑取可疑菌落于洁净的载玻片上 ，滴加适量 ３％过氧化氢溶液 ，立即产生气泡者为阳性 。β型溶血性链球菌触酶为阴性 。 ６．４．２　链激酶试验 （选做项目 ） 吸取草酸钾血浆 ０． ２ｍＬ，加０． ８ｍＬ 灭菌生理盐水 ，混匀，再加入经 ３ ６℃±１℃ 培养１ ８ｈ～２ ４ｈ的可疑菌的 Ｔ Ｓ Ｂ培养液０． ５ｍＬ 及０． ２ ５％氯化钙溶液 ０． ２ ５ｍＬ ，振荡摇匀 ，置于３ ６ ℃±１ ℃ 水浴中 １ ０ｍ ｉ ｎ，血浆混合物自行凝固 （凝固程度至试管倒置 ，内容物不流动 ） 。继续３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ，凝固块重新完全溶解为阳性 ，不溶解即为阴性 ，β型溶血性链球菌为阳性 。 ６．４．３　其他试验 使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定 。 ７　结果报告 综合以上溶血性链球菌的形态学 、生理生化试验的结果 ，报告１ｇ（ｍＬ）样品中检出 （或未检出 ）溶血性链球菌 。 ２犛 犖／犜４ ６ ２ ４．５—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犃（规范性附录 ） 培养基和试剂 犃．１　生理盐水 犃．１．１　成分 氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ８． ５ｇ蒸馏水 １０ ０ ０ｍＬ 犃．１．２　制法 称取８． ５ｇ氯化钠溶于 １０ ０ ０ｍＬ 蒸馏水中 ，１ ２ １℃高压灭菌 １ ５ｍ ｉ ｎ。 犃．２　改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基 （犿 犜 犛 犅） 犃．２．１　基础培养基 （胰蛋白胨大豆肉汤 犜 犛 犅） 犃．２．１．１　成分 胰蛋白胨 １ ７． ０ｇ大豆蛋白胨 ３． ０ｇ氯化钠 ５． ０ｇ磷酸氢二钾 （无水） ２． ５ｇ葡萄糖 ２． ５ｇ蒸馏水 １０ ０ ０ｍＬ 犃．２．１．２　制法 将Ａ． ２． １． １ 中各成分溶于蒸馏水 ，加热溶解 ，校正ｐＨ至７． ３±０． ２ ，１ ２ １℃灭菌１ ５ｍ ｉ ｎ，备用。 犃．２．２　抗生素溶液 犃．２．２．１　多黏菌素溶液 称取１ ０ｍｇ多黏菌素 Ｂ于１ ０ｍＬ灭菌蒸馏水中 ，振摇混匀 ，充分溶解后过滤除菌 。 犃．２．２．２　萘啶酮酸钠溶液 称取１ ０ｍｇ萘啶酮酸于 １ ０ｍＬ０． ０ ５ｍ ｏ ｌ ／Ｌ氢氧化钠溶液中 ，振摇混匀 ，充分溶解后过滤除菌 。 犃．２．３　完全培养基 犃．２．３．１　成分 胰蛋白胨大豆肉汤 （Ｔ Ｓ Ｂ） １０ ０ ０ｍＬ多粘菌素溶液 １ ０． ０ｍＬ萘啶酮酸钠溶液 １ ０． ０ｍＬ ３犛 犖／犜４ ６ ２ ４．５—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.犃．２．３．２　制法 无菌条件下 ，将Ａ． ２． ３． １ 中各成分进行混合 ，充分混匀 ，分装备用 。 犃．３　哥伦比亚 犆 犖 犃血琼脂 犃．３．１　成分 胰酪蛋白胨 １ ７． ０ｇ动物组织蛋白消化液 ５． ０ｇ酵母提取物 ３． ０ｇ牛肉提取物 ３． ０ｇ玉米淀粉 ３． ０ｇ氯化钠 ５． ０ｇ琼脂 １ ３． ５ｇ多粘菌素 ０． ０ １ｇ萘啶酸 ０． ０ １ｇ蒸馏水 １０ ０ ０ｍＬ 犃．３．２　制法 将Ａ． ３． １中各成分溶于蒸馏水 ，加热溶解 ，校正ｐＨ至７． ３±０． ２ ，１ ２ １℃灭菌１ ２ｍ ｉ ｎ，待冷却至约 ５ ０℃时加５ ０ｍＬ，无菌脱纤维羊血 ，摇匀后倒平板 。 犃．４　哥伦比亚血琼脂 犃．４．１　基础培养基 犃．４．１．１　成分 动物组织酶解物 ２ ３． ０ｇ淀粉 １． ０ｇ氯化钠 ５． ０ｇ琼脂 ８． ０ｇ～１ ８． ０ｇ蒸馏水 １０ ０ ０ｍＬ 犃．４．１．２　制法 将基础培养基成分溶解于蒸馏水中 ，加热促其溶解 。１ ２ １℃高压灭菌 １ ５ｍ ｉ ｎ。 犃．４．２　无菌脱纤维绵羊血 无菌条件下 ，将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中 ，振摇约１ ０ｍ ｉ ｎ，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可 。 犃．４．３　完全培养基 犃．４．３．１　组分 基础培养基 １０ ０ ０ｍＬ ４犛 犖／犜４ ６ ２ ４．５—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.无菌脱纤维绵羊血 ５ ０ｍＬ 犃．４．３．２　制法 当基础培养基的温度为 ４ ５℃左右时，无菌加入绵阳血 ，混匀。校正ｐＨ至７． ２±０． ２ 。倾注１ ５ｍＬ于无菌平皿中 ，静置至培养基凝固 。使用前需预先干燥平板 。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过４ｈ，或在４℃冷藏不得超过 ７ｄ。 犃．５　草酸钾血浆 犃．５．１　成分 人血 ５ｍＬ草酸钾 ０． ０ １ｇ