书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ６ ２ ４．３—２ ０ １ ６ 入境环保用微生物菌剂检测方法第３部分：巨大芽孢杆菌 犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊犳 狅 狉犲 狓 犪 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犻 犿 狆狅 狉 狋犿 犻 犮 狉 狅 犫 犻 犪 犾犫 犾 犲 狀 犱 狊 犻 狀狋 犺 犲犲 狀 狏 犻 狉 狅 狀 犿 犲 狀 狋 犪 犾 狆狉 狅 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀 —犘 犪 狉 狋３：犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊犿 犲 犵犪 狋 犲 狉 犻 狌 犿 ２ ０ １ ６０ ８２ ３发布 ２ ０ １ ７０ ３０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４《入境环保用微生物菌剂检测方法 》共分为１ ７部分： — — —第１部分：地衣芽孢杆菌 ； — — —第２部分：短小芽孢杆菌 ； — — —第３部分：巨大芽孢杆菌 ； — — —第４部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ； — — —第５部分：β型溶血性链球菌 ； — — —第６部分：金黄色葡萄球菌 ； — — —第７部分：沙门氏菌 ； — — —第８部分：志贺氏菌 ； — — —第９部分：致泻大肠埃希氏菌 ； — — —第１ ０部分：淡紫拟青霉 ； — — —第１ １部分：雅致小克银汉霉 ； — — —第１ ２部分：哈茨木霉 ； — — —第１ ３部分：黄孢原毛平革菌 ； — — —第１ ４部分：焦曲霉； — — —第１ ５部分：解淀粉芽孢杆菌 ； — — —第１ ６部分：类产碱假单胞菌 ； — — —第１ ７部分：恶臭假单胞菌 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４的第３部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 。本部分起草人 ：王芳、刘娇、徐宜宏、贾琳、贺瑞。 Ⅰ犛 犖／犜４ ６ ２ ４．３—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.入境环保用微生物菌剂检测方法第３部分：巨大芽孢杆菌 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４的本部分规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验巨大芽孢杆菌的形态学鉴定 、生化鉴定、分子生物学检测方法 。本部分适用于入境环保用微生物菌剂符合性检验巨大芽孢杆菌检测和鉴定 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　主要试剂和培养基 ３．１　实验用水 （应符合Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的规格 ） 。 ３．２　营养琼脂 ：见附录Ａ中Ａ． １。 ３．３　营养肉汤 ：见Ａ． ２。 ３．４　革兰氏染色法相关试剂 ：见Ａ． ３。 ３．５　接触酶：见Ａ． ４。 ３．６　氧化酶：见Ａ． ５。 ３．７　糖发酵管 ：见Ａ． ６。 ３．８　柠檬酸盐 ：见Ａ． ７。 ３．９　硝酸盐还原 ：见Ａ． ８。 ３．１ ０　淀粉水解 ：见Ａ． ９。 ３．１ １　明胶：见Ａ． １ ０。 ３．１ ２　Ｔ Ｅ缓冲液（ｐＨ ８． ０） ：见Ａ． １ １。 ３．１ ３　１％～３％琼脂糖凝胶 ：见Ａ． １ ２。 ３．１ ４　２ ５ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＥ ＤＴＡ ：见Ａ． １ ３。 ３．１ ５　３ｍ ｏ ｌ／Ｌ醋酸钠：见Ａ． １ ４。 ３．１ ６　ｄ ＮＴ Ｐ：ｄ ＡＴ Ｐ、ｄ ＴＴ Ｐ、ｄ ＧＴ Ｐ、ｄ Ｃ Ｔ Ｐ。 ３．１ ７　Ｔ Ｂ Ｅ：见Ａ． １ ５。 ３．１ ８　犜 犪狇ＤＮＡ聚合酶。 ３．１ ９　细菌基因组 ＤＮＡ提取试剂盒 。 ３．２ ０　琼脂糖。 ３．２ １　溴化乙锭 。 ３．２ ２　ＤＮＡ分子量标记 ：１ ０ ０ｂｐＤＮＡｌ ａ ｄ ｄ ｅ ｒ 。 １犛 犖／犜４ ６ ２ ４．３—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４　主要仪器和设备 ４．１　电子天平 （感量０． ０ １ｇ） 。 ４．２　恒温培养箱 ：３ ６℃±１℃ 、５ ０℃±１℃ 。 ４．３　恒温振荡培养箱 ：３ ６℃±１℃ 。 ４．４　恒温水浴锅 。 ４．５　台式冷冻离心机 （最高转速 １ ５０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ） 。 ４．６　Ｐ Ｃ Ｒ扩增仪。 ４．７　生物显微镜 ：１ ０×～１ ０ ０×。 ４．８　厌氧培养装置 ：３ ６℃±１℃ 。 ４．９　微量移液器和灭菌吸头 ：１ ０μＬ、２ ０μＬ、２ ０ ０μＬ、１０ ０ ０μＬ。 ４．１ ０　高压灭菌锅 。 ４．１ １　Ｐ Ｃ Ｒ超净工作台 。 ４．１ ２　电泳仪。 ４．１ ３　核酸／蛋白分析仪 。 ４．１ ４　凝胶成像系统 。 ４．１ ５　无菌培养皿 ：直径９ ０ｍｍ。 ５　样品制备 、培养 ５．１　以无菌操作取 １ｇ（ｍＬ）样品加入到 １ ０ ０ｍＬ 生理盐水中混匀 ，移取１环菌连续划线接种 ５个营养琼脂平板 ，３ ６℃±１℃ 培养１ ８ｈ～２ ４ｈ。取样过程中 ，在样品旁边放置 １个营养琼脂平板作为空白对照。 ５．２　挑取平板上 ３个～５个白色不透明菌落进行形态学鉴定 。 ５．３　挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养 ，３ ６℃±１℃ 条件下培养 １ ８ｈ～２ ４ｈ；再从纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤 ，３ ６℃±１℃ 条件下１ ８ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ振荡培养 １ ８ｈ～２ ４ｈ。 ６　形态学鉴定 ６．１　培养性状 巨大芽孢杆菌在营养琼脂上的菌落白色 、不透明，表面有光泽或较暗 ，有时微皱 ，生长后期一般带黄色。 ６．２　形态特征 革兰氏染色及芽孢染色 ：将５． ２中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色和芽孢染色 ，镜检。巨大芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌 ，菌体宽度 １． ２μｍ～１． ５μｍ，长度２． ０μｍ～５． ０μｍ，内生孢子 ，芽孢不膨大 ，不形成伴胞晶体 。 ７　生化鉴定法 取５． ２中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定 ，每个生化管加入 １ ０ ０μＬ增菌肉汤 。巨大芽孢杆菌生化特征见表 １。 ２犛 犖／犜４ ６ ２ ４．３—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.表１　巨大芽孢杆菌生化特征 鉴定项目 巨大芽孢杆菌 接触酶 ＋ 氧化酶 ＋ 厌氧生长 － 葡萄糖 ＋ 木糖 ＋／－ Ｌ 阿拉伯糖 ＋／－ 甘露醇 ＋／－ 利用葡萄糖产气 － 利用柠檬酸盐 ＋ 硝酸盐还原 ＋／－ ５ ０℃生长 － ｐＨ５． ７生长 ＋／－ ７％ Ｎ ａ Ｃ ｌ 生长 ＋／－ 淀粉水解 ＋ 明胶液化 ＋ ８　分子生物学检测 ８．１．１　直接提取法 取５． ２中菌液２ｍＬ加到２ｍＬ无菌离心管中 ，１ ００ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心２ｍ ｉ ｎ，尽量弃净上清 ，沉淀加入 Ｔ Ｅ １ ０ ０μＬ、１ ０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶１ ０ ０μＬ，３ ７℃温育３ ０ｍ ｉ ｎ，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心２ｍ ｉ ｎ，沉淀加入 Ｔ Ｅ缓冲液６ ０ ０μＬ重悬，再加入１ ５ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ ２ ５μＬ，５ ５℃温育１ｈ后沸水浴 １ ０ｍ ｉ ｎ，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心 ５ｍ ｉ ｎ，取上清保存于 －２ ０℃以待检测 。 ８．１．２　有机溶剂提取法 取５． ２中菌液２ｍＬ加到２ｍＬ无菌离心管中 ，１ ００ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心２ｍ ｉ ｎ，尽量弃净上清 ，沉淀加入 Ｔ Ｅ缓冲液５ ７ ０μＬ重悬，然后加入 １ ０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶１ ０ ０μＬ，３ ７℃温育３ ０ｍ ｉ ｎ，再加入１ ０％Ｓ Ｄ Ｓ３ ０ μＬ， ６ ５℃温育１ ０ｍ ｉ ｎ，加入等体积的酚混匀 ，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｍ ｉ ｎ，取上清移入一新离心管中 ，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚 ／氯仿（１∶１体积比）混匀，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｍ ｉ ｎ，取上清再移入一新离心管中 ，加等体积的无水乙醇 ，１／１ ０体积的３ｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸钠，轻缓颠倒混匀 ，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｍ ｉ ｎ，弃上清，沉淀用５ ０ ０μＬ ７ ５％乙醇洗两次 ，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发 ，加入 １ ０ ０μＬ无菌水，－２ ０℃保存以待检测 。 ８．１．３　试剂盒法 使用商品化的细菌基因组 ＤＮＡ提取试剂盒 ，具体提取操作参照说明书进行 。选择商业化试剂盒 的原则是所提取的 ＤＮＡ质量好并且提取率高 。 ３犛 犖／犜４ ６ ２ ４．３—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.８．２　犇 犖 犃质量检测 将提取的 ＤＮＡ用１． ０％的琼脂糖凝胶 （含溴化乙锭或等效染料 ）进行完整性检测 。采用分光光度法测定 ＤＮＡ的浓度和纯度 。ＤＮＡ浓度（ｎｇ／μＬ）计算公式为 ： ＤＮＡ浓度＝ＯＤ ２ ６ ０×５ ０×核酸稀释倍数若ＯＤ２ ６ ０／ＯＤ２ ８ ０在１． ８～２． ０之间，表明ＤＮＡ纯度较好 ，可用于Ｐ Ｃ Ｒ检测。 ８．３　犘 犆 犚鉴定 ８．３．１　引物序列 引物序列及扩增片段长度见表 ２。 表２　引物序列及扩增片段长度 名称 引物序列 （５ ′  ３ ′） 扩增片段大小 巨大芽孢杆菌ＣＡＡＴＧＧ Ｃ ＴＧＴＴ Ｃ ＧＴＴＴ Ｃ Ｇ ＴＴＧ Ｃ