以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.18 —2021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第 18 部分：短短芽孢杆菌 Test method of import microbe agentia in the environment protection - Part 18: Brevibacillus brevisr 2021 -06-18发布 2022 -01-01 实施ICS 11.020 CCS C 62 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 4624.18—2021I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件为 SN/T 4624《入境环保用微生物菌剂检测方法》的第 18 部分。SN/T 4624 已经发布了以 下部分： ——第 1 部分：地衣芽孢杆菌 ——第 2 部分：短小芽孢杆菌——第 3 部分：巨大芽孢杆菌 ——第 4 部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ——第 5 部分： β型溶血性链球菌 ——第 6 部分：金黄色葡萄球菌 ——第 7 部分：沙门氏菌——第 8 部分：志贺氏菌——第 9 部分：致泻大肠埃希氏菌——第 10 部分：淡紫拟青霉——第 11 部分：雅致小克银汉霉 ——第 12 部分：哈茨木霉 ——第 13 部分：黄孢原毛平革菌——第 14 部分：焦曲霉——第 15 部分：解淀粉芽孢杆菌——第 16 部分：类产碱假单胞菌——第 17 部分：恶臭假单胞菌——第 18 部分：短短芽孢杆菌——第 19 部分：红串红球菌——第 20 部分：泛养副球菌本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国沈阳海关、二连浩特国际旅行卫生保健中心。本部分主要起草人：王金玲、张莹、杨喜凤、罗力涵、李大力。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 4624.18—2021入境环保用微生物菌剂检测方法 第 18 部分 短短芽孢杆菌 1 范围 本文件规定了入境环保用微生物菌剂短短芽孢杆菌（ Brevibacillus brevis ）的形态学鉴定、生化鉴 定、实时荧光 PCR 检测方法。 本文件适用于入境环保用微生物菌剂短短芽孢杆菌检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文件的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 4 短短芽孢杆菌分类地位 学名： Brevibacillus brevis 。 分类地位：芽孢杆菌科（Bacillaceae） ，短芽孢杆菌属（ Brevibacillus ）。 5 方法原理 分离纯化菌株后，进行形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光 PCR 检测，根据菌的形态特征结果、 生化鉴定结果、实时荧光 PCR 特异性片段扩增结果，3 项结果都符合时判断该菌是否为目标菌株。 6 仪器设备 6.1 电子天平（感量 0.01 g） 。 6.2 恒温培养箱：30 ℃ ±1 ℃、50 ℃ ±1 ℃。 6.3 恒温振荡培养箱：30 ℃ ±1 ℃。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 台式冷冻离心机（最高转速 15 000 r/min） 。 6.6 PCR 扩增仪。 6.7 生物显微镜：10×~100×。以正式出版文本为准2 SN/T 4624.18—20216.8 厌氧培养装置：30 ℃ ±1 ℃。 6.9 微量移液器和灭菌吸头：10 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL。 6.10 高压灭菌锅。 6.11 PCR 超净工作台。 6.12 电泳仪。 6.13 核酸 / 蛋白分析仪。 6.14 凝胶成像系统。 6.15 无菌培养皿：直径 90 mm。 7 主要试剂和培养基 7.1 实验用水（应符合 GB/T 6682 中一级水的规格） 。 7.2 营养琼脂：按附录 A 中 A.1 配制。 7.3 营养肉汤：按附录 A 中 A.2 配制。 7.4 革兰氏染色法相关试剂：按附录 A 中 A.3 配制。 7.5 芽孢染色法相关试剂：按附录 A 中 A.4 配制。 7.6 接触酶：按附录 A 中 A.5 配制。 7.7 氧化酶：按附录 A 中 A.6 配制。 7.8 糖发酵管（葡萄糖、木糖、L -阿拉伯糖、甘露醇） ：按附录 A 中 A.7 配制。 7.9 硝酸盐还原：按附录 A 中 A.8 配制。 7.10 7 %NaCl 生长：按附录 A 中 A.9 配制。 7.11 淀粉水解：按附录 A 中 A.10 配制。 7.12 明胶：按附录 A 中 A.11 配制。 7.13 TE 缓冲液（pH 值 8.0） ：按附录 A 中 A.12 配制。 7.14 1 %~3 % 琼脂糖凝胶：按附录 A 中 A.13 配制。 7.15 25 mM EDTA ：按附录 A 中 A.14 配制。 7.16 3 M 醋酸钠：按附录 A 中 A.15 配制。 7.17 dNTP ：dATP、dTTP、dGTP、dCTP 配制。 7.18 TBE ：按附录 A 中 A.16 配制。 7.19 Taq DNA 聚合酶。 7.20 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 7.21 琼脂糖。 7.22 溴化乙锭。 7.23 DNA 分子量标记：100 bp DNA l adder。 8 样品制备、培养 8.1 以无菌操作取 1 g（mL）样品加入到 100 mL 生理盐水中混匀，移取 1 环菌连续划线接种 5 个营 养琼脂平板，30 ℃ ±1 ℃培养 18 h~24 h。取样过程中，在样品旁边放置 1 个营养琼脂平板作为空白 对照。 8.2 挑取平板上 3~5 个菌落平坦、光滑，色泽白色，生长后期一般黄灰色的菌落进行形态学鉴定。 8.3 挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，30 ℃ ±1 ℃条件下培养 18 h~24 h ；再从 纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，30 ℃ ±1 ℃条件下 180 r/min 振荡培养 18 h~24 h。以正式出版文本为准3 SN/T 4624.18—20219 形态学鉴定 9.1 培养性状 短短芽孢杆菌在营养琼脂上的菌落平坦、光滑，色泽白色，生长后期一般黄灰色。 9.2 形态特征 革兰氏染色及芽孢染色：将 8.2 中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，将该平板在冰箱中放置 48 h 待形成芽孢后，进行芽孢染色，镜检。 短短芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，菌体宽度 1.2 μm~1.5 μm，长度 2.0 μm~5.0 μm，内生孢子，芽 孢不膨大，不形成伴胞晶体。 10 生化鉴定 也可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等。 取 8.3 中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每个生化管加入 100 μL 增菌肉汤。 短短芽孢杆菌生化特征见表 1。 表 1 短短芽孢杆菌生化特征 鉴定项目 短短芽孢杆菌 接触酶 + 氧化酶 +/- 厌氧生长 + 葡萄糖 + 木糖 - L-阿拉伯糖 - 甘露醇 + 硝酸盐还原 + 50 ℃生长 + pH 值 5.7 生长 - 7 % NaCl 生长 + 淀粉水解 - 明胶液化 + 11 分子生物学检测 11.1 细菌模板 DNA 的提取 11.1.1 直接提取法 取 8.3 中菌液 1 mL 加到 1.5 mL 无菌离心管中，10 000 r/min 离心 2 min，尽量弃净上清液（如果以正式出版文本为准4 SN/T 4624.18—2021肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作） 。沉淀加入 TE 100 μL、10 mg/mL 溶菌酶 100 μL， 37 ℃温育 30 min，12 000 r/min 离心 2 min，沉淀加入 TE 缓冲液 600 μL 重悬，再加入 15 mg/mL 蛋白 酶Ｋ 25 μL，55 ℃温育 1 h 后沸水浴 10 min，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液保存于 -20 ℃保存以 待检测。 11.1.2 有机溶剂提取法 取 8.3 中菌液 1 mL 加到 1.5 mL 无菌离心管中，10 000 r/min 离心 2 min，尽量弃净上清液（如果 肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作） 。沉淀加入 TE 缓冲液 570 μL 重悬，然后加入 10 mg/mL 溶菌酶 100 μL，37 ℃温育 30 min，再加入 10 % SDS 30 μL，65 ℃温育 10 min，加入等体积 的酚混匀，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清 液加等体积的酚／氯仿（1∶1，体积比）混匀，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，沉淀用 500 μL75 % 乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加入 100 μL无 菌水（预先加热至 65 ℃有利于 DNA 溶解） ，-20