书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ６ ２ ４．１ １—２ ０ １ ６ 入境环保用微生物菌剂检测方法第１ １部分：雅致小克银汉霉 犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊犳 狅 狉犲 狓 犪 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犻 犿 狆狅 狉 狋犿 犻 犮 狉 狅 犫 犻 犪 犾犫 犾 犲 狀 犱 狊 犻 狀狋 犺 犲犲 狀 狏 犻 狉 狅 狀 犿 犲 狀 狋 犪 犾狆狉 狅 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀 —犘 犪 狉 狋１ １：犆 狌 狀 狀 犻 狀犵犺 犪 犿 犲 犾 犾 犪犲 犾 犲 犵犪 狀 狊 ２ ０ １ ６０ ８２ ３发布 ２ ０ １ ７０ ３０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４《入境环保用微生物菌剂检测方法 》共分为１ ７部分。 — — —第１部分：地衣芽孢杆菌 ； — — —第２部分：短小芽孢杆菌 ； — — —第３部分：巨大芽孢杆菌 ； — — —第４部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ； — — —第５部分：β型溶血性链球菌 ； — — —第６部分：金黄色葡萄球菌 ； — — —第７部分：沙门氏菌 ； — — —第８部分：志贺氏菌 ； — — —第９部分：致泻大肠埃希氏菌 ； — — —第１ ０部分：淡紫拟青霉 ； — — —第１ １部分：雅致小克银汉霉 ； — — —第１ ２部分：哈茨木霉 ； — — —第１ ３部分：黄孢原毛平革菌 ； — — —第１ ４部分：焦曲霉； — — —第１ ５部分：解淀粉芽孢杆菌 ； — — —第１ ６部分：类产碱假单胞菌 ； — — —第１ ７部分：恶臭假单胞菌 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４的第１ １部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 、沈阳药科大学 。本部分主要起草人 ：李俊环、王秋艳、徐慰倬、贺瑞、张新元、王芳。 Ⅰ犛 犖／犜４ ６ ２ ４．１ １—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.入境环保用微生物菌剂检测方法第１ １部分：雅致小克银汉霉 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ２ ４的本部分规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉的形态学鉴定 、实时荧光Ｐ Ｃ Ｒ检测方法 。本部分适用于入境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉检测和鉴定 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　主要试剂和培养基 ３．１　实验用水应符合 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的规格 。 ３．２　马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （Ｐ ＤＡ） ：见附录Ａ中Ａ． １。 ３．３　马铃薯葡萄糖液体培养基 ：见Ａ． ２。 ３．４　Ｃ ＴＡＢ缓冲液：见Ａ． ３。 ３．５　蛋白酶Ｋ。 ３．６　Ｔ ｒ ｉ ｓ饱和酚。 ３．７　三氯甲烷 。 ３．８　异戊醇。 ３．９　异丙醇。 ３．１ ０　Ｔ Ｅ缓冲液（ｐＨ８． ０） ：见Ａ． ４。 ３．１ １　７ ０％乙醇。 ３．１ ２　溴化乙锭 。 ３．１ ３　ＤＮＡ分子量标记 ：１０ ０ ０ｂｐＤＮＡｌ ａ ｄ ｄ ｅ ｒ 。 ３．１ ４　琼脂糖。 ３．１ ５　５ ０×ＴＡＥ 缓冲液（ｐＨ８． ５） ：见Ａ． ５。 ３．１ ６　Ｒ ｅ ａ ｌＭ ａ ｓ ｔ ｅ ｒＭ ｉ ｘ （２． ５×，含ＲＯＸ内参染料 ） 。 ３．１ ７　２ ０×Ｐ ｒ ｏ ｂ ｅＥ ｎ ｈ ａ ｎ ｃ ｅ ｒＳ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ 。 ３．１ ８　液氮。 ４　主要设备和材料 ４．１　电子天平 （感量０． ０ １ｇ） 。 ４．２　恒温培养箱 ：２ ５℃±１℃ 。 １犛 犖／犜４ ６ ２ ４．１ １—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．３　恒温振荡器 ：２ ５℃±１℃ 。 ４．４　恒温水浴锅 。 ４．５　台式冷冻离心机 （最高转速 １ ５０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ） 。 ４．６　Ｐ Ｃ Ｒ超净工作台 。 ４．７　实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ仪。 ４．８　微量移液器和灭菌吸头 ：１ ０μＬ、２ ０μＬ、２ ０ ０μＬ、１０ ０ ０μＬ。 ４．９　高压灭菌锅 。 ４．１ ０　电泳仪装置 。 ４．１ １　核酸／蛋白分析仪 。 ４．１ ２　凝胶成像系统 。 ４．１ ３　陶瓷研钵 。 ４．１ ４　无菌培养皿 ：直径９ ０ｍｍ。 ４．１ ５　灭菌三角烧瓶 ：５ ０ ０ｍＬ ，２ ５ ０ｍＬ 。 ４．１ ６　接种棒、镍铬丝。 ４．１ ７　Ｅｐ ｐｅ ｎ ｄ ｏ ｒ ｆ管和Ｐ Ｃ Ｒ反应管。 ４．１ ８　显微镜：物镜１ ０×～１ ０ ０×。 ５　样品制备 、培养 ５．１　无菌操作取 １ｇ（ｍＬ）样品加入到 １ ０ ０ｍＬ 无菌水中混匀 ，移取１环菌液连续划线接种 ５个Ｐ ＤＡ琼脂平板，２ ５℃±１℃ 条件下培养 ３ｄ～５ｄ，观察琼脂平板上的菌落特征 。取样过程中 ，在样品旁边放置 １个Ｐ ＤＡ平板作为空白对照 。 ５．２　挑取单菌落划线接种在 Ｐ ＤＡ平板上，２ ５℃±１℃ 条件下培养 ３ｄ～５ｄ，得到纯化的菌株 ，进行形态学鉴定 。 ５．３　挑取符合形态学特征单菌落转入马铃薯 葡萄糖液体培养基中 ，２ ５℃±１℃ 条件下１ ８ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ振荡培养３ｄ～５ｄ，获得菌丝体 。 ６　鉴定特征 ６．１　培养性状 雅致小克银汉霉生长迅速 ，接种Ｐ ＤＡ平板，２ ５℃培养３ｄ后菌落直径为 ８ ０ｍｍ 左右，高１ ０ｍｍ～１ ５ｍｍ 左右，表面长绒絮状 ，灰黑色，反面暗黄或深灰黑色 。 ６．２　形态特征 囊轴倒梨形 ，项囊直径 ５． ２μｍ～１ ２． ５μｍ，小孢囊黑褐色 ，球形至椭圆形 ，表面粗糙 ，直径６． ５μｍ～８． ３μｍ或（８． ０μｍ～９． ３μｍ）×（６． ８μｍ～８． ２μｍ） 。 ７　分子生物学检测 ７．１　模板犇 犖 犃的提取 ７．１．１　直接提取法 取５． ３中菌液过滤抽干收集菌丝 ，取０． １ｇ菌丝于液氮中研磨至粉末状 ，收集粉末于 １． ５ｍＬ 离心管 ２犛 犖／犜４ ６ ２ ４．１ １—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.中，加入５ ０ ０μＬＣ ＴＡＢ 缓冲液（其中含０． １ｇ蛋白酶Ｋ）混匀，６ ５℃水浴１ｈ；１ ３０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心５ｍ ｉ ｎ～１ ０ｍ ｉ ｎ，保留上清液 ；加５ ０ ０μＬＴ ｒ ｉ ｓ饱和酚∶三氯甲烷 ∶异戊醇（体积为２ ５∶２ ４∶１ ）混匀，１ ３０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ离心５ｍ ｉ ｎ～１ ０ｍ ｉ ｎ，保留上清液 ；加５ ０ ０μＬ三氯甲烷 ∶异戊醇（体积为２ ４∶１）混匀，１ ３０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心 ５ｍ ｉ ｎ～１ ０ｍ ｉ ｎ，保留上清液 ；加入１ｍＬ异丙醇混匀 ，－７ ０℃下放置１ｈ，或－２ ０℃过夜；１ ３０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心３ ０ｍ ｉ ｎ，可见ＤＮＡ沉淀；７ ０％乙醇冲洗 ＤＮＡ沉淀，室温干燥 ；用５ ０μＬ～１ ０ ０μＬＴ Ｅ溶解ＤＮＡ，置于－２ ０℃下保存备用 。 ７．１．２　试剂盒法 使用商品化的真菌基因组 ＤＮＡ提取试剂盒 ，具体提取操作参照说明书进行 。选择商品化试剂盒的原则是所提取的 ＤＮＡ质量好并且提取率高 。 ７．１．３　犇 犖 犃质量检测 将提取的 ＤＮＡ用１． ０％的琼脂糖凝胶 （含溴化乙锭或等效染料 ）进行完整性检测 。采用分光光度法测定 ＤＮＡ的浓度和纯度 。ＤＮＡ浓度计算公式 ： ＤＮＡ浓度（ｎｇ／μＬ）＝ＯＤ ２ ６ ０×５ ０×核酸稀释倍数若ＯＤ２ ６ ０／ＯＤ２ ８ ０在１． ８～２． ０之间，表明ＤＮＡ纯度较好 ，可用于实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ检测。 ７．２　实时荧光 犘 犆 犚鉴定 ７．２．１　引物和探针序列 引物和探针序列见表 １。其中探针的 ５ ′端标记ＦＡＭ，３ ′端标记ＴＡＭＲＡ 。 表１　引物和探针序列 名称 引 　物　序　列 探　针　序　列 雅致小克 银汉霉５ ′  Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ Ｇ Ｇ ＧＡＡＧ ＧＡ Ｔ Ｇ Ｃ Ａ  ３ ′ ５ ′  Ｃ Ｃ ＡＧ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ ３ ′５ ′ Ｆ ＡＭ  Ｔ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ ＡＧ Ｃ ＧＡ Ｃ Ａ Ｔ ＡＭＲＡ ３ ′ ７．２．２　实时荧光 犘 犆 犚反应体系 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ反应体系见表 ２。 表２　实时荧光 犘 犆 犚反应体系 试　剂　名　称 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ反应体系 ２． ５×Ｒ ｅ ａ ｌＭ ａ ｓ ｔ ｅ ｒＭ ｉ ｘ １ ０μＬ 正向引物 （２ ０ｐｍ ｏ ｌ／μＬ） １μＬ 反向引物 （２ ０ｐｍ ｏ ｌ／μＬ） １μＬ 探针（３ｐｍ ｏ ｌ／μＬ） １μＬ ２ ０×Ｐ ｒ ｏ ｂ ｅＥ ｎ ｈ ａ ｎ ｃ ｅ ｒｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ １． ２ ５μＬ ＤＮＡ模板 ２ ０ｎｇ ｄ ｄ Ｈ ２Ｏ 补充至２ ５μＬ 　　注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。 ３犛