书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ５ ４ ７—２ ０ １ ７ 代替Ｓ Ｎ／Ｔ１ ８ ９ ６—２ ０ ０ ７ 商品化试剂盒检测方法大肠菌群和大肠杆菌 　方法一 犆 狅 犿犿 犲 狉 犮 犻 犪 犾犽 犻 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱 —犆 狅 犾 犻 犳 狅 狉 犿 狊犪 狀 犱犲 狊 犮 犺 犲 狉 犻 犮 犺 犻 犪犮 狅 犾 犻 —犜 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱 Ⅰ ２ ０ １ ７０ ５１ ２发布 ２ ０ １ ７１ ２０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本标准代替 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ８ ９ ６—２ ０ ０ ７《食品中大肠菌群和大肠杆菌快速计数法 Ｐ ｅ ｔ ｒ ｉ ｆ ｉ ｌ ｍＴＭ测试片法 》 。与Ｓ Ｎ／Ｔ１ ８ ９ ６—２ ０ ０ ７相比，除编辑性修改外主要技术变化如下 ： — — —修改了标准的中英文名称 ； — — —修改了附录 Ａ； — — —增加了计算公式 ； — — —删除了第二法 Ｐ ｅ ｔ ｒ ｉ ｆ ｉ ｌ ｍＴＭ测试片ＭＰ Ｎ法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 、大连启元科技发展有限公司 。本标准起草人 ：刘淑艳、颜怀玉、王刚、丁健、尹琪、蒋丹、孙晓飞、万超、吴斌、林长军、卢行安、周振亚。本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： — — —Ｓ Ｎ／Ｔ１ ８ ９ ６—２ ０ ０ ７。 Ⅰ犛 犖／犜４ ５ ４ ７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.商品化试剂盒检测方法大肠菌群和大肠杆菌 　方法一 １　范围 本标准规定了食品中大肠杆菌 ／大肠菌群检验测试片 （Ｐ ｅ ｔ ｒ ｉ ｆ ｉ ｌ ｍＴＭ犈．犮 狅 犾 犻／Ｃ ｏ ｌ ｉ ｆ ｏ ｒ ｍＣ ｏ ｕ ｎ ｔＰ ｌ ａ ｔ ｅ ）的检测方法 。本标准适用于食品和原料中大肠菌群和大肠杆菌的计数 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 　实验室　生物安全通用要求 ３　生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染 ，应由具备资格的工作人员检测 。所有培养物和废弃物的处理应按照 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 有关规定执行 。 ４　技术概要 大肠杆菌 ／大肠菌群检验测试片法是用一种预先制备的含有指示剂及冷水可溶性凝胶的培养基系统进行微生物培养的方法 。大肠杆菌 ／大肠菌群测试片含有 ＶＲ Ｂ（Ｖ ｉ ｏ ｌ ｅ ｔＲ ｅ ｄＢ ｉ ｌ ｅ ）培养基和 β葡萄糖苷酸酶指示剂 ，大肠杆菌产生的β葡萄糖苷酸酶与培养基中的指示剂反应 ，显示为蓝色并带有气泡的特征菌落 ；大肠菌群细菌发酵乳糖产酸产气 ，与ｐＨ指示剂反应显示为红色并带有气泡的特征菌落 。 ５　设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外 ，其他设备和材料如下 ： ５．１　恒温培养箱 ：３ ６℃±１℃ 。 ５．２　电子天平 ：感量０． １ｇ。 ５．３　均质器（旋刀式或拍击式 ）或等效的设备 。 ５．４　ｐＨ计或精密 ｐＨ试纸。 ５．５　测试片压板 。 ５．６　放大镜或 ／和菌落计数器 。 ６　培养基和试剂 ６．１　无菌生理盐水 ：见附录Ａ的Ａ． １。 １犛 犖／犜４ ５ ４ ７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６．２　磷酸盐缓冲液 ：见附录Ａ的Ａ． ２。 ６．３　１ｍ ｏ ｌ／ＬＮ ａ ＯＨ ：见附录Ａ的Ａ． ３。 ６．４　１ｍ ｏ ｌ／ＬＨＣ ｌ：见附录Ａ的Ａ． ４。 ６．５　大肠杆菌 ／大肠菌群测试片 。本标准使用的试剂盒由美国 ３Ｍ有限公司生产 ，参考Ｓ Ｎ／Ｔ２ ７ ７ ５—２ ０ １ １和Ｓ Ｎ／Ｔ３ ２ ６ ６—２ ０ １ ２，由国家认监委商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价 。具体评价结果参见附录 Ｂ。测试片储存于 ２℃～８℃，有效期１ ８个月。 ７　检测程序 检测程序见图 １。 图１　大肠菌群和大肠杆菌测试片计数法检测程序 ８　操作步骤 ８．１　样品制备 ８．１．１　固体和半固体样品 ：称取２ ５ｇ样品置盛有 ２ ２ ５ｍＬ 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯中 ， ８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ～１ ００ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ均质１ｍ ｉ ｎ～２ｍ ｉ ｎ，或放入盛有 ２ ２ ５ｍＬ 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中 ，用拍击式均质器拍打 １ｍ ｉ ｎ～２ｍ ｉ ｎ，制成１∶１ ０的样品匀液 。 ８．１．２　液体样品 ：以无菌吸管吸取 ２ ５ｍＬ样品置盛有 ２ ２ ５ｍＬ 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ）中，充分混匀 ，制成１∶１ ０的样品匀液 。样品匀液的 ｐＨ值应为 ６． ５～７． ５，ｐＨ值过低或过高时可分别采用 １ｍ ｏ ｌ／ＬＮ ａ ＯＨ 调节或１ｍ ｏ ｌ／ＬＨＣ ｌ予以调节 。如为冷冻产品 ，应在４ ５℃以下不超过 １ ５ｍ ｉ ｎ，或２℃～５℃不超过１ ８ｈ解冻。 ８．１．３　用１ｍＬ无菌吸管或微量移液器吸取 １∶１ ０样品匀液 １ｍＬ，沿管壁缓缓注入 ９ｍＬ磷酸盐缓冲 液或生理盐水的无菌试管中 （注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面 ） ，振摇试管 ，使其混合均匀 ，制成 ２犛 犖／犜４ ５ ４ ７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.１∶１ ０ ０ 的样品匀液 。 ８．１．４　按８． １． ３操作程序 ，依次制成 １ ０倍递增系列稀释样品匀液 。每递增稀释 １次，换用１支１ｍＬ无菌吸管或吸头 。从制备样品匀液至样品接种完毕 ，全过程不得超过 １ ５ｍ ｉ ｎ。 ８．２　样品匀液的接种和培养 根据对样品的污染状况的估计及相关限量要求 ，选取２个～３个适宜的连续稀释度的样品匀液 （液体样品可以选择原液 ） ，每个稀释度接种 ２张测试片 。同时，分别吸取 １ｍＬ磷酸盐缓冲液或生理盐水加入两张测试片内作为空白对照 。 ８．３　接种 将大肠杆菌 ／大肠菌群测试片置于平坦实验台面 ，揭开上层膜 ，用吸管吸取 １ｍＬ样品匀液垂直滴加在测试片的中央 ，将上层膜缓慢盖下 ，避免气泡产生和上层膜直接落下 ，把压板（平面底朝下 ）放置在上层膜中央 ，轻轻地压下 ，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上 。拿起压板 ，静置至少 １ｍ ｉ ｎ以使培养基凝固。 ８．４　培养 将测试片的透明面朝上 ，水平置于培养箱内 ，堆叠片数不超过 ２ ０片，培养温度为 ３ ６℃±１℃ 。大肠菌群检测时培养时间为 ２ ４ｈ±２ｈ ；大肠杆菌检测时 ，如果是肉 、家禽或水产品培养时间为 ２ ４ｈ±２ｈ ，如果是其他产品 ，培养时间为 ４ ８ｈ±２ｈ 。 ９　结果计算与报告 ９．１　判读 ９．１．１　可用肉眼观察 ，必要时用放大镜或菌落计数器 ，记录稀释倍数和相应的大肠菌群或大肠杆菌菌落数量。菌落计数以菌落形成单位 （ｃ ｏ ｌ ｏ ｎｙ ｆ ｏ ｒ ｍ ｉ ｎｇｕ ｎ ｉ ｔ ｓ，Ｃ ＦＵ）表示。 ９．１．２　在大肠杆菌 ／大肠菌群测试片上 ，蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌 。蓝色有气泡和红色有气泡的菌落数之和为大肠菌群数 。测试片圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不做计数 。出现大量气泡形成、不明显的小菌落 ，培养区呈蓝色或暗红时 ，进一步稀释样品可获得准确的读数 。 ９．２　菌落计数与报告 ９．２．１　选取菌落数在 １ ５Ｃ ＦＵ ～１ ５ ０Ｃ ＦＵ 之间的测试片计数大肠菌群或大肠杆菌菌落总数 。低于 １ ５Ｃ ＦＵ 的测试片记录具体菌落数 ，大于１ ５ ０Ｃ ＦＵ 的记录为多不可计 。每个稀释度的大肠菌群或大肠杆菌菌落数应采用两个测试片的平均数 。 ９．２．２　若只有一个稀释度的测试片的菌落数在适宜计数范围内 ，计算两个测试片大肠菌群或大肠杆菌菌落数的平均值 ，再将平均值乘以相应稀释倍数 ，作为每克 （或每毫升 ）样品中大肠菌群或大肠杆菌菌落总数结果 。 ９．２．３　若有两个连续稀释度的测试片菌落数在适宜计数范围内 ，按式（１）计算。 犖＝ ∑犪（狀１＋０ ． １狀２）犱……………………（ １） 　　式中： 犖　— — —样品中大肠菌群 ／大肠杆菌总数 ； ∑犪— — —测试片（含适宜范围菌落数的测试片 ）大肠菌群或大肠杆菌菌落数之和 ； 狀１— — —第一稀释度 （低稀释倍数 ）测试片个数 ； ３犛 犖／犜４ ５ ４ ７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.狀２— — —第二稀释度 （高稀释倍数 ）测试片个数 ； 犱— — —稀释因子 （第一稀释度 ） 。 ９．２．４　若所有稀释度测试片上的菌落数都小于 １ ５Ｃ ＦＵ ，则应按稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数计算 。 ９．２．５　若所有稀释度 （包括液体样品原液 ）的测试片上均无菌落生长 ，则以小于 １乘以最低稀释倍数计算。 ９．２．６　若所有稀释度的测试片菌落数均不在 １ ５Ｃ ＦＵ ～１ ５ ０Ｃ ＦＵ 之间，其中一部分小于 １ ５Ｃ ＦＵ 或大于１ ５ ０Ｃ ＦＵ 时，则以最接近 １ ５Ｃ ＦＵ