SN-T 4545.1-2016 商品化试剂盒检测方法沙门氏菌方法一

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４５４５．１—２０１６商品化试剂盒检测方法沙门氏菌　方法一犆狅犿犿犲狉犮犻犪犾犽犻狋犿犲狋犺狅犱 —犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪 —犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱 Ⅰ ２０１６０８２３发布２０１７０３０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本部分是ＳＮ／Ｔ４５４５的第１部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：邵碧英、郑晶、董健、陈彬、黄晓蓉、彭华毅、林杰。 Ⅰ犛犖／犜４５４５．１—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.商品化试剂盒检测方法沙门氏菌　方法一１　范围ＳＮ／Ｔ４５４５的本部分规定了食品中沙门氏菌的环介导恒温核酸扩增（ＬＡＭＰ）检测方法。本部分适用于家禽、鱼类和海产品、乳制品和杂品中沙门氏菌的筛选检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ４７８９．４　食品安全国家标准　食品微生物学检验　沙门氏菌检验ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ２７７５　商品化食品检测试剂盒评价方法ＳＮ／Ｔ３２６６　食品微生物检验方法确认技术规范３　生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌。所有培养物、ＤＮＡ提取物和废弃物应按照ＧＢ１９４８９和ＧＢ／Ｔ２７４０３中的有关规定执行。４　技术概要利用环介导恒温扩增（ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术进行沙门氏菌的筛选检测。根据沙门氏菌属特有靶序列上的６个独立区域，采用４条特异引物及一种链置换活性的ＤＮＡ聚合酶，在６５℃左右完成恒温扩增。在环介导恒温扩增反应中，产生肉眼可见的副产物焦磷酸镁乳白色沉淀，反应产物在荧光染料的作用下，阴阳性结果产生显色差异，即可通过颜色变化观察判定结果。５　试剂和材料５．１　沙门氏菌核酸犔犃犕犘检测试剂盒本试剂盒参考ＳＮ／Ｔ２７７５和ＳＮ／Ｔ３２６６由国家认监委商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见附录Ａ。试剂盒组成如下：ａ）　ＤＮＡ提取液。ｂ）　沙门氏菌ＨＦ反应管：为环介导恒温扩增反应管，每管内含２２．５μＬ工作液（包括反应液及ＢｓｔＤＮＡ聚合酶），２μＬ显色液和５０μＬ稳定液。１犛犖／犜４５４５．１—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.ｃ）　阳性对照：沙门氏菌ＤＮＡ。ｄ）　阴性对照。试剂盒储存于－２０℃以下，有效期６个月。试剂盒内各试剂使用前，充分解冻，并避免反复冻融。５．２　沙门氏菌质控菌株实验室保存的沙门氏菌标准菌株或沙门氏菌标准菌株的ＤＮＡ。６　仪器和设备６．１　移液器：量程０．５μＬ～１０μＬ；量程１０μＬ～１００μＬ；量程１００μＬ～１０００μＬ。６．２　高速台式离心机：转速不低于１００００ｒ／ｍｉｎ，最大相对离心力不低于７０００ｇ。６．３　水浴锅或加热模块：６５℃±１℃ 和１００℃±１℃ 。６．４　计时器。７　检测程序食品中沙门氏菌ＬＡＭＰ检测程序见图１。图１　食品中沙门氏菌犔犃犕犘检测程序２犛犖／犜４５４５．１—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.８　操作步骤８．１　样品制备、增菌培养按照ＧＢ４７８９．４进行样品制备、增菌和分离。８．２　细菌模板犇犖犃的制备８．２．１　增菌液模板犇犖犃的制备对于从８．１获得的缓冲蛋白胨水增菌液，采用如下方法制备模板ＤＮＡ：ａ）　直接取该增菌液１ｍＬ加到１．５ｍＬ无菌离心管中，１００００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，尽量吸弃上清液；ｂ）　加入８０μＬＤＮＡ提取液，混匀后沸水浴１０ｍｉｎ，置冰上１０ｍｉｎ；ｃ）　１００００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，上清液即为模板ＤＮＡ作为试样待测；取上清液置－２０℃ 可保存６个月备用。８．２．２　可疑菌落模板犇犖犃的制备对于８．１分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照８．２．１ｂ）步骤制备模板ＤＮＡ作为试样待检测。８．３　环介导恒温核酸扩增８．３．１　空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应必须设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照以水替代ＤＮＡ模板。阴性对照和阳性对照可使用试剂盒中自带的，也可使用实验室自行制备的阴性对照和阳性对照。当使用试剂盒中阴性对照和阳性对照时，应定期进行核查。阴性对照制备：２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ，２ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ  １００（ｐＨ８．０）。阳性对照制备：将沙门氏菌标准菌株接种于营养肉汤中，３６℃培养１８ｈ～２４ｈ，用无菌生理盐水稀释至１０６ＣＦＵ／ｍＬ～１０８ＣＦＵ／ｍＬ（约麦氏浊度０．４），按８．２．１提取模板ＤＮＡ作为ＬＡＭＰ反应的模板。８．３．２　反应过程反应过程操作如下：ａ）　取出足够试验用的沙门氏菌ＨＦ反应管，于室温解冻；ｂ）　分别吸取阴性对照、阳性对照和待测ＤＮＡ试样各２．５μＬ加入到不同的沙门氏菌ＨＦ反应管中，每个样品做２个平行管，注意加样时枪头要穿透稳定液层至工作液中；ｃ）　将反应管置于６５℃恒温扩增反应６０ｍｉｎ。８．４　结果观察反应结果，将反应管倒置甩动２次，再正置甩动２次，使工作液与显色液充分混合，冷却至室温后，在黑色背景下观察。９　结果判定与报告在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：３犛犖／犜４５４５．１—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.ａ）　待检样品２个平行反应管液体至少１管呈绿色，该样品结果为沙门氏菌初筛阳性，需对样品的二次增菌液或可疑纯菌落按ＧＢ４７８９．４进行确认，并报告结果；ｂ）　待检样品２个平行反应管液体均呈橙色，则沙门氏菌检验结果为阴性，报告未检出。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。４犛犖／犜４５４５．１—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）沙门氏菌犔犃犕犘检测试剂盒评价结果１）犃．１　包容性和排他性选择１００株经确认的沙门氏菌标准菌株和分离菌株，用ＬＡＭＰ试剂盒方法进行测试，结果全部为阳性。选择３０株经确认的非沙门氏菌的标准菌株，用试剂盒方法进行测试，结果全部为阴性。犃．２　灵敏度、特异性、准确度及检测限选择５个食品种类，１５个食品类型的样品，采用人工污染的方式分别制备未接种（Ｌ０）、低（Ｌ１）、高（Ｌ２）三个污染水平试验样品，分别用ＬＡＭＰ方法和ＧＢ４７８９．４方法进行测试，相对灵敏度、特异性、准确度及检测限结果如表Ａ．１。表犃．１　灵敏度、特异性、准确度及检测限序号食品基质相对准确度ＡＣ相对特异性ＳＰ相对灵敏度ＳＥ检出限和置信区间／（ＣＦＵ／ｇ）１家禽１００％１００％１００％１．１２（０．４７～２．７１）２鱼类和海产品１００％１００％１００％１．１２（０．４７～２．７１）３蔬菜制品７６％１００％２７％未检出（１．１２ＣＦＵ／ｇ水平）４乳制品９７％１００％９５％０．１１（０．０２～０．５３）５杂品１００％１００％１００％１．１２（０．４７～２．７１）犃．３　耐变性分别对反应温度（正常设置为６５℃）和反应时间（正常设置为６０ｍｉｎ）两个变量进行耐变性实验，检测结果表明，超出反应温度与反应时间，则可能出现假阳性或假阴性。犃．４　批间变异取３个不同批号试剂盒分别对含目标菌和非目标菌样

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