SN-T 4525.5-2016 出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法第5部分克罗诺杆菌

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４５２５．５—２０１６出口食品中致病菌的分子分型　犕犔犛犜方法第５部分：克罗诺杆菌犕狌犾狋犻犾狅犮狌狊狊犲狇狌犲狀犮犲狋狔狆犻狀犵犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱 —犘犪狉狋５：犆狉狅狀狅犫犪犮狋犲狉狊狆狆．２０１６０６２８发布２０１７０２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ４５２５《出口食品中致病菌的分子分型　ＭＬＳＴ方法》共分１０个部分： — — —第１部分：沙门氏菌； — — —第２部分：金黄色葡萄球菌； — — —第３部分：副溶血性弧菌； — — —第４部分：霍乱弧菌； — — —第５部分：克罗诺杆菌； — — —第６部分：化脓链球菌； — — —第７部分：空肠弯曲菌； — — —第８部分：致泻性大肠埃希氏菌； — — —第９部分：单核细胞增生李斯特氏菌； — — —第１０部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为ＳＮ／Ｔ４５２５的第５部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：王娉、陈颖、赵晓燕、蒋原、薛峰、赵晓美。 Ⅰ犛犖／犜４５２５．５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.出口食品中致病菌的分子分型　犕犔犛犜方法第５部分：克罗诺杆菌１　范围ＳＮ／Ｔ４５２５的本部分规定了出口食品中克罗诺杆菌的分子分型ＭＬＳＴ检测方法。本部分适用于出口食品中克罗诺杆菌的分子分型检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ４７８９．４０ —２０１０　食品安全国家标准　食品微生物学检验　阪崎肠杆菌检验ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和实验方法ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测３　术语和定义、缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１管家基因　犺狅狌狊犲  犽犲犲狆犻狀犵犵犲狀犲狊所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。３．１．２犜犪狇犇犖犃酶　犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊犇犖犃狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲从犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊细菌中提取的耐热ＤＮＡ聚合酶。３．２　缩略语下列缩略语适用于本文件。ｄＮＴＰ：脱氧核糖核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸（ＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｅＴｅｔｒａａｃｅｔｉｃＡｃｉｄ）ＭＬＳＴ：多位点序列分型（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ）ＳＴ：序列型（ＳｅｑｕｅｎｃｅＴｙｐｅ）Ｔｒｉｓ：三（羟甲基）氨基甲烷［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］４　原理ＭＬＳＴ是通过测定多个管家基因中长度约为４７０ｂｐ核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编１犛犖／犜４５２５．５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。ＭＬＳＴ分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。５　试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的要求。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的容器分装。５．１　犈狓犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。５．２　ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。５．３　ＤＮＡ提取试剂：ＤＮＡ提取试剂盒。５．４　１０×犈狓犜犪狇Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２）。５．５　琼脂糖。５．６　ＴＡＥ缓冲液：２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．４），１ｍｏｌ／Ｌ乙酸，１００ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ。５．７　参考菌株：克罗诺杆菌ＡＴＣＣ２９５４４。６　仪器和设备６．１　ＰＣＲ扩增仪。６．２　离心机。６．３　核酸蛋白分析仪。６．４　电泳仪。６．５　分子凝胶成像仪。６．６　微量移液器和灭菌吸头：１０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ。６．７　恒温培养箱。６．８　恒温水浴锅。６．９　天平。６．１０　灭菌三角烧瓶：５００ｍＬ、２５０ｍＬ。６．１１　灭菌平皿：９０ｍｍ×１５ｍｍ。６．１２　灭菌试管：内径３ｍｍ，长５ｃｍ。７　检测程序对克罗诺杆菌７对管家基因ａｔｐＤ、ｆｕｓＡ、ｇｌｎＳ、ｇｌｔＢ、ｇｙｒＢ、ｉｎｆＢ、ｐｐｓ分别设计引物，并进行ＰＣＲ扩增（引物序列见表Ａ．２），对扩增结果阳性的样品进行克隆测序，将所得到的克罗诺杆菌７对管家基因测序结果上下游序列整合后得到完整序列，将测序结果上传至ＭＬＳＴ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｌｓｔ．ｎｅｔ）进行在线数据分析，得到的结果与ＭＬＳＴ数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定克罗诺杆菌分离株的序列型（ＳｅｑｕｅｎｃｅＴｙｐｅ，ＳＴ），并与ＰｕｂＭＬＳＴ数据库中菌株的资料进行比较。在确定ＳＴｓ的基础上应用ＭＥＧＡ程序对菌株进行聚类分析（参见附录Ｂ）。ＭＬＳＴ的操作程序见图１。２犛犖／犜４５２５．５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.图１　犕犔犛犜操作程序８　检测步骤８．１　提取细菌基因组犇犖犃取经过ＧＢ４７８９．４０ —２０１０鉴定为克罗诺杆菌的增菌液，提取基因组ＤＮＡ。８．２　犕犔犛犜基因选择选择克罗诺杆菌的７个管家基因作为目的基因进行ＭＬＳＴ分析，如表Ａ．１所示，它们分别是ＡＴＰ合成β链基因（ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅｃｈａｉｎ，ａｔｐＤ）、伸长因子Ｇ基因（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ｆｕｓＡ）、谷氨酰胺酰基 ｔＲＮＡ合成酶基因（Ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ  ｔＲＮＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｇｌｎＳ）、谷氨酰胺合成酶大亚基基因（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｓｙｎ ｔｈａｓｅｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔ，ｇｌｔＢ）、ＤＮＡ解旋酶Ｂ亚基基因（ＤＮＡｇｙｒａｓｅＢ，ｇｙｒＢ）、翻译起始因子ＩＦ  ２基因（ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＩＦ  ２，ｉｎｆＢ）、磷酸合成酶基因（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ｐｐｓ）。８．３　犘犆犚引物和测序引物的选择针对表Ａ．１中克罗诺杆菌７个目的基因，合成７对相应的ＰＣＲ引物序列（表Ａ．２）。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到１０μｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存备用。８．４　目的基因片段的犘犆犚扩增反应体系体积为５０μＬ：１０×犈狓犜犪狇Ｂｕｆｆｅｒ５ μＬ、引物对（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）３犛犖／犜４５２５．５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.２．５μＬ、犈狓犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ、水３８μＬ、模板ＤＮＡ２μＬ。反应条件：９５℃预变

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