SN-T 4525.4-2016 出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法第4部分霍乱弧菌

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４５２５．４—２０１６出口食品中致病菌的分子分型　犕犔犛犜方法第４部分：霍乱弧菌犕狌犾狋犻犾狅犮狌狊狊犲狇狌犲狀犮犲狋狔狆犻狀犵犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱 —犘犪狉狋４：犞犻犫狉犻狅犮犺狅犾犲狉犪２０１６０６２８发布２０１７０２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ４５２５《出口食品中致病菌的分子分型　ＭＬＳＴ方法》共分１０个部分： — — —第１部分：沙门氏菌； — — —第２部分：金黄色葡萄球菌； — — —第３部分：副溶血性弧菌； — — —第４部分：霍乱弧菌； — — —第５部分：克罗诺杆菌； — — —第６部分：化脓链球菌； — — —第７部分：空肠弯曲菌； — — —第８部分：致泻性大肠埃希氏菌： — — —第９部分：单核细胞增生李斯特氏菌； — — —第１０部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为ＳＮ／Ｔ４５２５的第４部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：付溥博、曾静、汪琦、张锡全、薛峰、蒋原、刘莉。 Ⅰ犛犖／犜４５２５．４—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.出口食品中致病菌的分子分型　犕犔犛犜方法第４部分：霍乱弧菌１　范围ＳＮ／Ｔ４５２５的本部分规定了出口食品中霍乱弧菌分子分型ＭＬＳＴ检测方法。本部分适用于出口食品中霍乱弧菌的分子分型检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ１０２２—２０１０　进出口食品中霍乱弧菌检验方法３　术语和定义、缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１管家基因　犺狅狌狊犲  犽犲犲狆犻狀犵犵犲狀犲狊所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。３．１．２犜犪狇犇犖犃酶　犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊犇犖犃狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲从犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊细菌中提取的耐热ＤＮＡ聚合酶。３．２　缩略语下列缩略语适用于本文件。ｄＮＴＰ：脱氧核糖核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸（ＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｅＴｅｔｒａａｃｅｔｉｃＡｃｉｄ）ＭＬＳＴ：多位点序列分型（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ）ＳＴ：序列型（ＳｅｑｕｅｎｃｅＴｙｐｅ）Ｔｒｉｓ：三（羟甲基）氨基甲烷［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］４　原理ＭＬＳＴ是通过测定多个管家基因中长度约为４７０ｂｐ核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编１犛犖／犜４５２５．４—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。ＭＬＳＴ分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。５　试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的要求。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的容器分装。５．１　ＤＮＡ提取试剂：细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒。５．２　犜犪狇ＤＮＡ酶。５．３　ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。５．４　引物：扩增引物和测序引物序列见表Ａ．２。５．５　１０×ＰＣＲ缓冲液：２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．４），２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。５．６　琼脂糖凝胶。５．７　Ｇｅｌｒｅｄ核酸染色剂。５．８　６×溴酚蓝上样缓冲液。５．９　分子量标记：１００ｂｐ～２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ。５．１０　５×ＴＢＥ电泳缓冲液：４４５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，４４５ｍｍｏｌ／Ｌ硼酸，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。使用时稀释为０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液。５．１１　质控菌株：霍乱弧菌Ｖｂ０非０１霍乱弧菌或等效菌株。６　仪器和设备６．１　离心机。６．２　天平：量程２ｋｇ，感量０．１ｇ。６．３　ｐＨ计。６．４　涡旋振荡器。６．５　ＰＣＲ仪。６．６　电泳仪。６．７　凝胶成像仪。６．８　基因测序仪。６．９　超净工作台。６．１０　移液器：０．１μＬ～２．５μＬ、２μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ。７　检测程序ＭＬＳＴ的操作程序见图１。２犛犖／犜４５２５．４—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.图１　犕犔犛犜操作程序８　检测步骤８．１　细菌基因组犇犖犃提取将经过ＳＮ／Ｔ１０２２—２０１０的方法鉴定为霍乱弧菌的菌株提取基因组ＤＮＡ。取待测样本１ｍＬ，加到１．５ｍＬ离心管中，８０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃去上清。加入７５０μＬＤＮＡ提取液，６５℃温浴３０ｍｉｎ，加酚∶三氯甲烷 ∶异戊醇（２５∶２４∶１）５００μＬ，振荡混匀，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸取５００μＬ上清液与４００μＬ的异丙醇充分混合，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，７５％乙醇冲洗沉淀一次，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去上清，沉淀干燥后溶于３０μＬＴＥ溶液中，立即用于检测或短期保存于－２０℃。注：也可使用其他经验证的ＤＮＡ提取方法或等效的商品化细菌ＤＮＡ提取试剂盒，按照其使用说明操作。８．２　犇犖犃浓度和纯度的测定取５μＬＤＮＡ溶液加双蒸水稀释至１ｍＬ，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸光值犃２６０和犃２８０。ＤＮＡ的浓度按式（１）计算：犮＝犃×犖×５０／１０００ …………………………（１）　　式中：犮— — —ＤＮＡ浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犃— — —２６０ｎｍ处的吸光值；３犛犖／犜４５２５．４—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.犖— — —核酸稀释倍数。当犃２６０／犃２８０比值在１．７～１．９之间时，适宜于ＰＣＲ扩增。８．３　犕犔犛犜基因选择按表Ａ．１所示，选择霍乱弧菌的７个管家基因进行ＭＬＳＴ分析。８．４　犘犆犚扩增引物和测序引物的选择按表Ａ．２中的序列，合成霍乱弧菌７个管家基因对应的７对ＰＣＲ扩增引物（测序引物）。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到１０μｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存备用。８．５　目的基因片段的犘犆犚扩增反应体系体积为５０μＬ：１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ、引物对（１０μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．４μＬ、模板ＤＮＡ５μＬ、水３３．６μＬ。反应条件为：９４℃５ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃３０ｓ，３５个循环；７２℃７ｍｉｎ。将ＰＣＲ产物进行２％琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行ＰＣ

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