SN-T 4485-2016 进出口口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４４８５—２０１６进出口口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法犕犲狋犺狅犱犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犅狌狉犽犺狅犾犱犲狉犻犪犮犲狆犪犮犻犪犻狀狅狉犪犾狊犪狀犻狋犪狉狔犪狆狆犾犻犪狀犮犲狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋２０１６０６２８发布２０１７０２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：韩伟、刘夏、谢小珏、黄菁菁。 Ⅰ犛犖／犜４４８５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.进出口口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法１　范围本标准规定了进出境口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌的检验方法。本标准适用于漱口水、牙膏、牙粉和口气清新剂等口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌的检验，其他伯克霍尔德菌的检验可参考使用。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求３　设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：ａ）　天平：感量０．１ｇ。ｂ）　锥形瓶或烧瓶。ｃ）　玻璃珠。ｄ）　膜过滤系统。ｅ）　无菌滤膜，孔径０．４５μｍ。ｆ）　无齿镊子。ｇ）　吸管：１０ｍＬ及１ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ。ｈ）　灭菌平皿：直径９０ｍｍ。ｉ）　培养箱：３５℃±１℃ 。ｊ）　接种环：直径３ｍｍ及１ｍｍ。ｋ）　ｐＨ计或ｐＨ比色管或ｐＨ精密试纸。ｌ）　显微镜：１０×～１００×。ｍ）　全自动微生物鉴定系统。４　培养基和试剂４．１　ＳＣＤＬＰ液体培养基：见Ａ．１。４．２　改良ＬＥＴＨＥＥＮ氏肉汤：见Ａ．２。４．３　洋葱伯克霍尔德菌琼脂：见Ａ．３。４．４　营养琼脂：见Ａ．４。４．５　３％过氧化氢溶液：临用前配制。４．６　Ｏ／Ｆ试验管：见Ａ．５。１犛犖／犜４４８５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.４．７　无菌液体石蜡。４．８　赖氨酸脱羧酶试验培养基：见Ａ．６。４．９　精氨酸双水解酶培养基：见Ａ．７。４．１０　碳源利用培养基：见Ａ．８。４．１１　西蒙氏柠檬酸盐培养基：见Ａ．９。４．１２　半固体琼脂培养基：见Ａ．１０。４．１３　非发酵菌生化鉴定试剂盒。５　检验程序洋葱伯克霍尔德菌检验程序见图１。图１　洋葱伯克霍尔德菌的检验程序６　操作步骤６．１　样品制备６．１．１　固体样品牙膏或牙粉等固体样品，称取１０ｇ，加到装有玻璃珠及９０ｍＬ的ＳＣＤＬＰ液体培养基的三角瓶中，充分振荡混匀，静置１５ｍｉｎ，作为１∶１０的稀释液。２犛犖／犜４４８５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.６．１．２　液体样品漱口水或口气清新喷雾等液体样品，吸取１０ｍＬ，加到含９０ｍＬ的ＳＣＤＬＰ液体培养基的三角瓶中，充分混匀作为１∶１０的稀释液；用灭菌无齿镊子夹取孔径为０．４５μｍ的无菌滤膜边缘，贴放在已灭菌的滤器上，固定，将稀释液倒入滤杯，打开抽滤阀门，负压抽滤；稀释液抽滤完后，关上抽滤阀门，将２０ｍＬＳＣＤＬＰ液体培养基倒入滤杯，再次抽滤作为漂洗，重复操作２次。６．２　增菌培养用无菌吸管移取固体样品１∶１０样品稀释液１０ｍＬ，加到９０ｍＬ改良ＬＥＴＨＥＥＮ氏肉汤中，３５℃±１℃ 培养４８ｈ±２ｈ。用灭菌无齿镊子夹取液体样品抽滤漂洗后的滤膜边缘，放入５０ｍＬ改良ＬＥＴＨＥＥＮ氏肉汤中，３５℃±１℃ 培养４８ｈ＋２ｈ。６．３　分离用３ｍｍ接种环挑取培养物，划线接种在洋葱伯克霍尔德菌琼脂，３５℃±１℃ 培养４８ｈ±２ｈ，观察菌落形态，洋葱伯克霍尔德菌落呈光滑圆形，鼠尾草绿色，周围培养基呈亮粉色。若菌落较小可再培养２４ｈ＋１ｈ后进行观察。６．４　筛选试验６．４．１　纯化：自洋葱伯克霍尔德菌琼脂平板上挑取２个以上典型或可疑菌落，接种到营养琼脂斜面上，３５℃±１℃ 培养２４ｈ±１ｈ。６．４．２　染色镜检：洋葱伯克霍尔德菌为革兰氏阴性杆菌，直或微弯。大小为０．５μｍ～１．０μｍ×１．５μｍ～５．０μｍ。６．４．３　过氧化氢酶试验：用接种环挑取纯培养物在洁净载玻片上，滴加１滴～２滴３％过氧化氢溶液，立即观察，在半分钟内出现小气泡则为过氧化氢酶阳性。６．４．４　葡萄糖氧化／发酵（犗／犉）试验：用１ｍｍ接种环挑取少量纯培养物，同时穿刺接种于２支Ｏ／Ｆ试验管中，其中１支滴加无菌液体石蜡覆盖培养基表面０．３ｍｍ～０．５ｍｍ以隔绝空气，作为封闭管，另取１支空白的Ｏ／Ｆ试验管，滴加无菌液体石蜡作为对照管，３５℃±１℃ 培养４８ｈ±２ｈ，观察。仅开放管变黄产酸的为氧化反应，开放管和封闭管均变黄产酸的为发酵反应，对照管应为阴性。６．４．５　赖氨酸脱羧酶试验：挑取少量纯培养物，接种到赖氨酸脱羧酶试验培养基中，３５℃±１℃ 培养４８ｈ±２ｈ，观察。黄色为阴性，紫色为阳性。６．５　鉴定试验６．５．１　生化试验：对符合革兰氏阴性杆菌、过氧化氢酶阳性、Ｏ／Ｆ试验仅为氧化反应、赖氨酸脱羧酶阳性的纯培养物继续进行鉴定。洋葱伯克霍尔德菌及同属主要细菌的生化特性见表１。表１　洋葱伯克霍尔德菌的生化特征与其他主要伯克霍尔德菌的区别生化反应洋葱伯克霍尔德菌鼻疽伯克霍尔德菌类鼻疽伯克霍尔德菌石竹伯克霍尔德菌唐菖蒲伯克霍尔德菌皮氏伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌精氨酸双水解酶— ＋＋＋ — — — 鼠李糖Ｖ — — ＋ — — — ３犛犖／犜４４８５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.表１（续）生化反应洋葱伯克霍尔德菌鼻疽伯克霍尔德菌类鼻疽伯克霍尔德菌石竹伯克霍尔德菌唐菖蒲伯克霍尔德菌皮氏伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌麦芽糖 — — ＋ — — — — ２，３ 丁二醇＋ — — ＋ — — — Ｄ 丙氨酸＋＋＋ — ＋＋＋亮氨酸＋ — ＋ — ＋ — ＋柠檬酸盐＋ — ＋＋＋ — ＋动力＋ — ＋＋＋＋＋　　注：“＋”表示阳性； “ —”表示阴性； “Ｖ”表示反应不定。６．５．２　如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统，可根据筛选试验的判断结果，用６．４．１中已培养的营养琼脂斜面上生长的纯菌，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统进行鉴定。７　结果报告综合以上试验结果，报告１０ｇ样品中检出或未检出洋葱伯克霍尔德菌。８　废弃物处理检测过程中的废弃物按照ＧＢ１９４８９的相关要求进行处理。４犛犖／犜４４８５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１　犛犆犇犔犘液体培养基犃．１．１　成分酪蛋白胨　　　　　　　　　　　　１７ｇ大豆蛋白胨３ｇ氯化钠５ｇ磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ）２．５ｇ葡萄糖２．５ｇ卵磷脂１ｇ吐温８０７ｇ水１０００ｍＬｐＨ７．２±０．２犃．１．２　制法先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成分混合，加热溶解在１０００ｍＬ水中，调节ｐＨ，分装适宜容器，１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ。犃．２　改良犔犈犜犎犈犈犖氏肉汤犃．２．１　成分蛋白胨２０．０ｇ酪蛋白胰酶消化物５．０ｇ牛肉膏５．０ｇ酵母膏２．０ｇ卵磷脂３．０ｇ吐温８０３０．０ｇ氯化钠５．０ｇ亚硫酸氢钠０．１ｇ水１０００ｍＬｐＨ７．２±０．２犃．２．２　制法将吐温８０和卵磷脂先后在少量蒸馏水中加温，直至完全溶解。经加热、搅拌加入其他成分进行溶解，调节ｐＨ值，分装适宜容器，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。５犛犖／犜４４８５—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.犃．３　洋葱伯克霍尔德菌琼脂犃．３．１　基础培养基犃．３．１．