SN-T 4463-2016 国境口岸布鲁氏菌荧光PCR检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４４６３—２０１６国境口岸布鲁氏菌荧光犘犆犚检测方法犜犲狊狋狅犳犅狉狌犮犲犾犾狅狊犻狊狑犻狋犺狉犲犪犾  狋犻犿犲犘犆犚犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１６０３０９发布２０１６１００１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准国境口岸布鲁氏菌荧光犘犆犚检测方法ＳＮ／Ｔ４４６３—２０１６ 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲２号（１０００２９）北京市西城区三里河北街１６号（１０００４５）总编室：（０１０）６８５３３５３３网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数１０千字２０１６年８月第一版　２０１６年８月第一次印刷印数１—１１００ 书号：１５５０６６·２  ３０４６４　定价１４．００元 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴忠华、吕沁风、郑伟、罗鹏、徐琦、何蕾、李莉、蔡玉峰、杨永耀。 Ⅰ犛犖／犜４４６３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸布鲁氏菌荧光犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸布鲁氏菌的荧光ＰＣＲ检测方法。本标准适用于国境口岸感染布鲁氏菌的人或动物以及被该菌污染的物品的荧光ＰＣＲ检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＷＳ２６９　布鲁氏菌病诊断标准３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）ｄＮＴＰ：脱氧核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＰＣＲ：聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）４　对象４．１　疑似感染布鲁氏菌的出入境人员或动物。４．２　疑似污染布鲁氏菌的物品。５　生物安全要求所有有关布鲁氏菌的实验室操作应按照以下规定执行： — — —大量活菌操作或动物感染实验在生物安全三级（ＢＳＬ  ３或ＡＢＳＬ  ３）实验室内进行； — — —布鲁氏菌标本检测操作在生物安全二级（ＢＳＬ  ２）实验室内进行； — — —布鲁氏菌相关的无感染性的材料操作在生物安全一级（ＢＳＬ  １）实验室内进行； — — —布鲁氏菌感染性材料运输包装分类为Ａ类，ＵＮ编号为ＵＮ２８１４。６　试剂在实验过程中需要以下试剂： — — —引物和探针： ●　上游引物ＢＲＦ１：５ ′  ｃａａｇｇｇｃａａｇｇｔｇｇａａｇａｔｔ  ３ ′； ●　下游引物ＢＲＲ１：５ ′  ｃｔｇｃｇａｃｃｇａｔｔｔｇａｔｇｔｔｔ  ３ ′； ●　荧光探针ＦＰＢＲ１：５ ′  ｆａｍ  ａｔｃｇｔｔｔｃｃｇｇｇｔａａａｇｃｇｔｃｇｃｃａ  Ｐ  ３ ′ ；１犛犖／犜４４６３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.●　淬灭探针ＱＰＢＲ１：５ ′  ｃｇｃｔｔｔａｃｃｃｇｇａａａｃｇａ  Ｄａｂｃｙｌ  ３ ′。 — — —荧光ＰＣＲ反应组分： ●　１０×缓冲液：１００ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ为８．０）、５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ、３０％甲酰胺、６０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２； ●　ｄＮＴＰｓ：每种核苷酸浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ； ●　犜犪狇酶：７５Ｕ／μＬ； ●　蛋白酶Ｋ消化液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ＰＨ８．０），１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．５％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ； ●　红细胞裂解液：５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ，２５ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ，５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，ｐＨ７．５。７　仪器设备在实验过程中需要以下仪器设备： — — —荧光定量ＰＣＲ仪； — — —水浴或者干浴器； — — —高速台式离心机（≥１００００犵）； — — —移液器：量程０．１μＬ～２．５μＬ，量程１μＬ～１０μＬ，量程１０μＬ～１００μＬ，量程１００μＬ～１０００μＬ。８　检测程序８．１　标本的采集８．１．１　血液标本：抽取人或动物静脉血３ｍＬ～５ｍＬ，放入带盖的ＥＤＴＡ抗凝管中，并做好标记送检。８．１．２　痰液标本：收集新鲜痰液３ｍＬ～５ｍＬ，取痰前先用３％Ｈ２Ｏ２漱口１次及清水漱口３次，用力咳出气管深处真正呼吸道分泌物，而勿混入唾液及鼻咽分泌物。８．１．３　动物组织标本：无菌操作取动物的肝、脾组织２ｇ～５ｇ，放入无菌容器中，并标记取样日期及部位。８．１．４　土壤或粉末状标本：无菌操作用采样勺取２ｇ～５ｇ标本置于无菌容器中密封保存。８．１．５　物体表面标本：采用无菌生理盐水湿润的无菌拭子擦拭物体表面（以１００ｃｍ２为宜），放入无菌容器中保存。８．２　标本的前处理８．２．１　血液标本：无需前处理，可直接用于ＤＮＡ提取。８．２．２　痰液标本：需先用２倍于标本体积的１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ消化，混匀振荡５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，静止消化３０ｍｉｎ，期间振荡２次～３次，使痰液充分液化，吸取０．５ｍＬ混悬液备用。８．２．３　动物组织标本：取０．２５ｇ标本，加入０．５ｍＬ无菌生理盐水，匀浆，静置１０ｍｉｎ，取上清液备用。８．２．４　土壤或粉末状标本：取０．２５ｇ标本，加入０．５ｍＬ无菌生理盐水，振荡摇匀，静置１０ｍｉｎ，取上清液备用。８．２．５　物体表面标本：采集的标本用０．５ｍＬ无菌生理盐水洗涤，振荡摇匀，静置１０ｍｉｎ，取上清液备用。８．３　增菌培养如需增菌按ＷＳ２６９操作。２犛犖／犜４４６３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.８．４　犇犖犃模板制备８．４．１　取０．５ｍＬ全血标本加入１ｍＬ红细胞裂解液，１２０００犵离心１０ｍｉｎ，弃去上清液后，加入５０μＬ～１００μＬ蛋白酶Ｋ消化液，５５℃消化１ｈ～３ｈ，９５℃灭活１０ｍｉｎ，离心１２００００犵３０ｓ，取上清液５μＬ作为荧光ＰＣＲ模板。也可使用市售等效ＤＮＡ抽提试剂盒。８．４．２　８．２．２、８．２．３、８．２．４及８．２．５处理的标本１２０００犵１０ｍｉｎ离心沉淀后弃去上清液，加入５０μＬ～１００μＬ蛋白酶Ｋ消化液，５５℃消化１ｈ～３ｈ，９５℃灭活１０ｍｉｎ，离心１２０００犵３０ｓ，取上清液５μＬ作为荧光ＰＣＲ模板。也可使用市售等效ＤＮＡ抽提试剂盒。８．５　荧光犘犆犚检测８．５．１　反应体系反应液组成见表１，也可使用市售等效布鲁氏菌荧光ＰＣＲ检测试剂盒。表１　布鲁氏菌荧光犘犆犚检测反应体系名称浓度体积终浓度模板／阴性对照／阳性对照５μＬ上游引物１２．５μｍｏｌ／Ｌ１ μＬ０．５μｍｏｌ／Ｌ下游引物１２．５μｍｏｌ／Ｌ１ μＬ０．５μｍｏｌ／Ｌ荧光探针５ｍｍｏｌ／Ｌ０．５ μＬ１００ｎｍｏｌ／Ｌ淬灭探针１０ｍｍｏｌ／Ｌ０．５ μＬ２００ｎｍｏｌ／Ｌ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶７５Ｕ／μＬ０．５ μＬ１．５Ｕ／μＬｄＮＴＰｓ１ｍｍｏｌ／Ｌ２．５ μＬ１００ μｍｏｌ／Ｌ１０×缓冲液１０× ２．５ μＬ１０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＫＣｌ、３％甲酰胺、６ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２ｄｄＨ２Ｏ补足水