书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ４ １ ９．２ １—２ ０ １ ６ 出口食品常见过敏原 犔 犃犕犘系列检测方法第２ １部分：牛奶 犉 狅 狅 犱犪 犾 犾 犲 狉 犵犲 狀犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狑 犻 狋 犺犔 犃犕犘犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊犳 狅 狉犲 狓 狆狅 狉 狋—犘 犪 狉 狋２ １：犕 犻 犾 犽 ２ ０ １ ６０ ３０ ９发布 ２ ０ １ ６１ ００ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ４ １ ９《出口食品常见过敏原 ＬＡＭＰ系列检测方法 》由下列部分组成 ： — — —第１部分：开心果； — — —第２部分：腰果； — — —第３部分：胡桃； — — —第４部分：榛果； — — —第５部分：杏仁； — — —第６部分：扁桃仁； — — —第７部分：巴西坚果 ； — — —第８部分：澳洲坚果 ； — — —第９部分：栗子； — — —第１ ０部分：大豆； — — —第１ １部分：羽扇豆； — — —第１ ２部分：花生； — — —第１ ３部分：葵花籽； — — —第１ ４部分：芝麻； — — —第１ ５部分：大麦； — — —第１ ６部分：小麦； — — —第１ ７部分：荞麦； — — —第１ ８部分：芥末； — — —第１ ９部分：胡萝卜； — — —第２ ０部分：芹菜； — — —第２ １部分：牛奶； — — —第２ ２部分：虾。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ４ １ ９的第２ １部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国北京出入境检验检疫局 。本部分主要起草人 ：曾静、张西萌、魏海燕、付溥博、陈颖、马丹、刘莉、赵晓娟。 Ⅰ犛 犖／犜４ ４ １ ９．２ １—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.出口食品常见过敏原 犔 犃犕犘系列检测方法第２ １部分：牛奶 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ４ １ ９的本部分规定了出口食品中过敏原牛奶成分的环介导等温扩增 （ＬＡＭＰ）检测方法 。本部分适用于食品及其原料中过敏原牛奶成分的定性检测 。本部分所规定方法的最低检测限 （ＬＯＤ）为０． ５％（质量分数 ） 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 Ｇ Ｂ／Ｔ２ ７ ４ ０ ３ —２ ０ ０ ８　实验室质量控制规范 　食品分子生物学检测 ３　术语、定义和缩略语 ３．１　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３．１．１过敏原　犪 犾 犾 犲 狉犵犲 狀又称致敏原或变应原 ，是指能够引起变态反应的抗原 。 ３．１．２牛奶　犿 犻 犾 犽一种白色的液体 ，由哺乳动物的乳腺分泌而来 ，是初生哺乳动物的主要食物来源 ，其中β乳球蛋白是牛奶致敏的主要成分 。 ３．２　缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ｄ ＮＴ Ｐ：脱氧核糖核苷三磷酸 （ｄ ｅ ｏ ｘｙｒ ｉ ｂ ｏ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｄ ｅｔ ｒ ｉ ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ） ＬＡＭＰ：环介导等温扩增 （ｌ ｏ ｏｐ ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ａ ｌａ ｍ ｐｌ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） Ｔ ｒ ｉ ｔ ｏ ｎＸ  １ ０ ０ ：聚乙二醇辛基苯基醚 ４　防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合 Ｇ Ｂ／Ｔ２ ７ ４ ０ ３ —２ ０ ０ ８中附录Ｄ的规定。 ５　方法提要 样品经浓缩后 ，提取ＤＮＡ，以ＤＮＡ为模板，采用牛线粒体细胞色素 ｂ（ｃｙｔ  ｂ）基因特异性检测引物 １犛 犖／犜４ ４ １ ９．２ １—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.进行ＬＡＭＰ扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原牛奶成分 。 ６　犔 犃犕犘检测方法 ６．１　原理 根据牛线粒体细胞色素 ｂ基因序列设计特异性内引物 、外引物各一对以及一条环引物 ，特异性识别 靶序列上的 ７个独立区域 ，利用犅 狊 狋ＤＮＡ聚合酶启动循环链置换反应 ，在线粒体特异靶序列启动互补 链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 环ＤＮＡ混合物；从ｄ ＮＴ Ｐ析 出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Ｍｇ２＋结合，产生副产物 （焦磷酸镁 ）形成乳白色沉淀 ， 加入显色液 ，即可通过颜色变化观察判定结果 。显色液显色原理 ：Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ Ⅰ是一种结合于所 有ｄ ｓ ＤＮＡ 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料 。在游离状态下 ，Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ Ⅰ发出微弱的荧 光，但一旦与 ｄ ｓ ＤＮＡ 结合后，荧光大大增强 。因此，Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ 的荧光信号强度与 ｄ ｓ ＤＮＡ 的数量相 关，可以根据荧光信号检测出 ＬＡＭＰ反应体系存在的 ｄ ｓ ＤＮＡ 数量。 ６．２　仪器和设备 ６．２．１　水浴锅或加热模板 ：６ ５℃±１℃ 和８ ０℃±１℃ 。 ６．２．２　离心管：０． １ｍＬ、１． ５ｍＬ。 ６．２．３　计时器。 ６．２．４　移液枪：量程０． ５μＬ～１ ０μＬ、量程１ ０μＬ～１ ０ ０μＬ、量程１ ０ ０μＬ～１０ ０ ０μＬ。 ６．３　试剂和材料 除另有规定外 ，所有试剂均为分析纯或生化试剂 。 ６．３．１　实验用水 ：应符合Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的规格 。 ６．３．２　Ｃ Ｔ Ａ Ｂ提取缓冲液 （２ ０ｇ／ＬＣ Ｔ Ａ Ｂ ，１． ４ｍ ｏ ｌ／ＬＮ ａ Ｃ ｌ，０． １ｍ ｏ ｌ／ＬＴ ｒ ｉ ｓ  ＨＣ ｌ ，０． ０ ２ｍ ｏ ｌ ／ＬＮ ａ ２Ｅ Ｄ Ｔ Ａ， ｐＨ８． ０） 。 ６．３．３　Ｃ ＴＡＢ沉淀液（５ｇ／ＬＣ ＴＡＢ ，４ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＮ ａ Ｃ ｌ） 。 ６．３．４　Ｎ ａ Ｃ ｌ溶液：１． ２ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ６．３．５　蛋白酶Ｋ（２ ０ｍｇ／ｍＬ） 。 ６．３．６　ｄ ＮＴ Ｐ ｓ 溶液：每种核苷酸浓度 １ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ６．３．７　犅 狊 狋ＤＮＡ聚合酶：酶浓度８Ｕ／μＬ。 ６．３．８　１ ０×Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ ｌ Ｐ ｏ ｌ 缓冲液：含２ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＴ ｒ ｉ ｓ  ＨＣ ｌ （ｐＨ８． ８） 、１ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ硫酸铵、１ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ 氯化钾、２ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ硫酸镁、１％ Ｔ ｒ ｉ ｔ ｏ ｎＸ  １ ０ ０ 。 ６．３．９　硫酸镁溶液 ：５ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ６．３．１ ０　甜菜碱：５ｍ ｏ ｌ／Ｌ。 ６．３．１ １　显色液：Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ Ⅰ荧光染料 ，１０ ０ ０× 。 ６．３．１ ２　引物：根据牛奶线粒体细胞色素 ｂ基因设计一套特异性引物 ，包括外引物 Ｆ ３／Ｂ ３，内引物Ｆ Ｉ Ｐ／ Ｂ Ｉ Ｐ，环引物Ｂ Ｌ Ｐ，见表１。 ２犛 犖／犜４ ４ １ ９．２ １—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.表１　引物序列 名称 编号 序列 ＬＡＭＰ引物序列外侧上游引物 （Ｆ ３） ５’ ＧＡＣＡＡＣ ＴＡＧ ＣＡＴ Ｃ ＴＧＴ Ｃ Ｃ ＴＡ ３ ’ 外侧下游引物 （Ｂ ３） ５’ ＣＡＧ Ｃ ＴＴＴＧＧＧＧＧＴＴＧＡＴＧ  ３ ’ 内侧上游引物 （Ｆ Ｉ Ｐ）５’ ＧＡＴＧＴＡＣ ＴＡＣＡＡＡＧＡＣ Ｃ ＴＧＴ Ｃ ＴＴ ＣＡＴＴＴ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ ＣＡＴ Ｃ Ｃ ＴＡＧＴＧ Ｃ  ３ ’ 内侧下游引物 （Ｂ Ｉ Ｐ）５’ ＴＡＣ ＴＧＧＴ Ｃ ＴＴＧＴＡＡＡＣ ＣＡＧＡＧＡＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧＴＴＴ Ｃ ＴＴ Ｃ Ｃ ＴＴＧＡＧＴ Ｃ  ３ ’ 下游环引物 （Ｂ Ｌ Ｐ） ５’ ＴＴＧＴＧ Ｃ Ｃ ＧＧ Ｃ Ｃ ＧＴＴＧＧＴ  ３ ’ ６．４　犇 犖 犃提取 ６．４．１　称取１ ０ ０ｍｇ已制备好的样品至 １． ５ｍＬ 离心管中 ，加入１ｍＬＣ ＴＡ Ｂ 提取缓冲液和 １ ０μＬ蛋白 酶Ｋ，６ ５℃１ｈ ，期间每隔 １ ０ｍ ｉ ｎ 振荡混匀 。 ６．４．２　１ ２０ ０ ０犵离心１ ０ｍ ｉ ｎ，吸取上清液 ７ ０ ０μＬ至一新１． ５ｍＬ 离心管中 。 ６．４．３　加入４ ９ ０μＬ氯仿，振荡混合后 ，１ ２０ ０ ０犵离心１ ０ｍ ｉ ｎ。 ６．４．４　吸取５ ０ ０μＬ上清液至一新 １． ５ｍＬ 管中。 ６．４．５　加入２倍体积Ｃ ＴＡＢ沉淀液，混匀后室温静置 ６ ０ｍ ｉ ｎ，１ ２０ ０ ０犵离心１ ０ｍ ｉ ｎ。 ６．４．６　弃去上清液 ，加入３ ５ ０μＬ１． ２ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＮ ａ Ｃ ｌ 溶液充分溶解沉淀 。 ６．４．７　加入３ ５ ０μＬ氯仿，高速漩涡振荡混匀 ，１ ２０ ０ ０犵离心１ ０ｍ ｉ ｎ。 ６．４．８　吸取上清液至一新 １． ５ｍＬ 管中，加入０． ８倍体积异丙醇 ，混匀，－２ ０℃静置２ ０ｍ ｉ ｎ，１ ２０ ０