SN-T 4419.19-2016 出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第19部分胡萝卜

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４４１９．１９—２０１６出口食品常见过敏原犔犃犕犘系列检测方法第１９部分：胡萝卜犉狅狅犱犪犾犾犲狉犵犲狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀狑犻狋犺犔犃犕犘犿犲狋犺狅犱狊犳狅狉犲狓狆狅狉狋—犘犪狉狋１９：犆犪狉狉狅狋２０１６０３０９发布２０１６１００１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ４４１９《出口食品常见过敏原ＬＡＭＰ系列检测方法》由下列部分组成： — — —第１部分：开心果； — — —第２部分：腰果； — — —第３部分：胡桃； — — —第４部分：榛果； — — —第５部分：杏仁； — — —第６部分：扁桃仁； — — —第７部分：巴西坚果； — — —第８部分：澳洲坚果； — — —第９部分：栗子； — — —第１０部分：大豆； — — —第１１部分：羽扇豆； — — —第１２部分：花生； — — —第１３部分：葵花籽； — — —第１４部分：芝麻； — — —第１５部分：大麦； — — —第１６部分：小麦； — — —第１７部分：荞麦； — — —第１８部分：芥末； — — —第１９部分：胡萝卜； — — —第２０部分：芹菜； — — —第２１部分：牛奶； — — —第２２部分：虾。本部分为ＳＮ／Ｔ４４１９的第１９部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：孙敏、高宏伟、刘彩霞、张舒亚、黄文胜、陈颖、韩建勋、邓婷婷、吴亚君。 Ⅰ犛犖／犜４４１９．１９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.出口食品常见过敏原犔犃犕犘系列检测方法第１９部分：胡萝卜１　范围ＳＮ／Ｔ４４１９的本部分规定了出口食品中过敏原胡萝卜成分的环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法。本部分适用于食品及其原料中过敏原胡萝卜成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检测限（ＬＯＤ）为０．１％（质量分数）。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ２７４０３ —２００８　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ１９６１．７ —２０１３　出口食品过敏原成分检测　第７部分：实时荧光ＰＣＲ方法检测胡萝卜成分３　术语、定义和缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１过敏原　犪犾犾犲狉犵犲狀又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。３．１．２胡萝卜　犮犪狉狉狅狋别名：胡芦菔，红萝卜，又称甘荀，属伞形科（Ａｐｉａｃｅａｅ）胡萝卜属（犇犪狌犮狌狊Ｌ．）。３．２　缩略语下列缩略语适用于本文件。ｄＮＴＰ：脱氧核糖核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＬＡＭＰ：环介导等温扩增（ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ＴｒｉｔｏｎＸ  １００：聚乙二醇辛基苯基醚４　防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合ＧＢ／Ｔ２７４０３ —２００８中附录Ｄ的规定。５　方法提要样品经研磨后，提取ＤＮＡ，以ＤＮＡ为模板，采用胡萝卜ＩＴＳ１  ５．８ＳＲＮＡ  ＩＴＳ２基因特异性检测引１犛犖／犜４４１９．１９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.物进行ＬＡＭＰ扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原胡萝卜成分。６　犔犃犕犘检测方法６．１　原理根据胡萝卜ＩＴＳ１  ５．８ＳＲＮＡ  ＩＴＳ２基因序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性识别靶序列上的８个独立区域。在链置换型ＤＮＡ聚合酶的作用下，内引物与模板ＤＮＡ退火、延伸，并利用外引物与模板ＤＮＡ的退火延伸置换出内引物合成链。由于内引物与相邻区域存在互补区，游离的内引物合成链折叠成茎 环结构，以自身为模板，启动链置换扩增循环，合成长度不一的大量茎 环结构ＤＮＡ。加入显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果。ＤＮＡ聚合反应析出的焦磷酸根离子与溶液中的Ｍｇ２＋结合，形成焦磷酸镁乳白色沉淀，故也可通过反应液的浊度变化观察判定结果。显色液显色原理：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ⅰ是一种结合于所有ｄｓＤＮＡ双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染料。在游离状态下，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ⅰ发出微弱的荧光，但一旦与ｄｓＤＮＡ结合后，荧光大大增强。因此，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ⅰ荧光的强度与ｄｓＤＮＡ的量正相关，可以根据ＬＡＭＰ反应液的荧光强度测定反应体系中的ｄｓＤＮＡ的量。６．２　仪器和设备６．２．１　水浴锅或加热模板：６５℃±１℃ 和８０℃±１℃ 。６．２．２　离心管：０．１ｍＬ、１．５ｍＬ。６．２．３　计时器。６．２．４　移液枪：量程０．５μＬ～１０μＬ、量程１０μＬ～１００μＬ、量程１００μＬ～１０００μＬ。６．３　试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。６．３．１　实验用水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。６．３．２　ＣＴＡＢ提取缓冲液（２０ｇ／ＬＣＴＡＢ，１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ，０．０２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）。６．３．３　ＣＴＡＢ沉淀液（５ｇ／ＬＣＴＡＢ，４０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）。６．３．４　ＮａＣｌ溶液：１．２ｍｍｏｌ／Ｌ。６．３．５　蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）。６．３．６　ｄＮＴＰｓ溶液：每种核苷酸浓度２５ｍｍｏｌ／Ｌ。６．３．７　犅狊狋ＤＮＡ聚合酶：酶浓度８Ｕ／μＬ。６．３．８　１０×ＴｈｅｒｍｏｌＰｏｌ缓冲液：含２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁、１％ＴｒｉｔｏｎＸ  １００。６．３．９　硫酸镁溶液：１００ｍｍｏｌ／Ｌ。６．３．１０　甜菜碱：５ｍｏｌ／Ｌ。６．３．１１　显色液：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ⅰ荧光染料，１０００× 。６．３．１２　引物：根据胡萝卜ＩＴＳ１  ５．８ＳＲＮＡ  ＩＴＳ２基因设计一套特异性引物，包括外引物Ｆ３／Ｂ３，内引物ＦＩＰ／ＢＩＰ，见表１。２犛犖／犜４４１９．１９—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.表１引物序列名称编号序列ＬＡＭＰ引物序列外侧上游引物（Ｆ３）５’ ＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣ  ３ ’ 外侧下游引物（Ｂ３）５’ ＧＣＴＴＡＡＡＣＴＣＡＧＣＧＧＧＴＡＧＴ  ３ ’ 内侧上游引物（ＦＩＰ）５’ ＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＧＧＴＴＧＧＣ  ３ ’ 内侧下游引物（ＢＩＰ）５’ ＧＴＣＧＴＴＧＴＧＴＡＴＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＧＧＴＣＡＣＡＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＡ  ３ ’ 上游环引物（ＬＦ）５’ ＣＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＴＴＴＴＴＧＡ  ３ ’ 下游环引物（ＬＢ）５’ ＧＧＣＣＣＴＴＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＡ  ３ ’ ６．４　犇犖犃提取６．４．１　称取１００ｍｇ已制备好的样品至１．５ｍＬ离心管中，加入１ｍＬＣＴＡＢ提取缓冲液和１０μＬ蛋白酶Ｋ，６５℃１ｈ，期间每隔１０ｍｉｎ振荡混匀。６．４．２　１２０００犵离心１０ｍｉｎ，吸取上清液７００μＬ至一新１．５ｍＬ离心管中。６．４．３　加入４９０μＬ氯仿，振荡混合后，１２０００犵离心１０ｍｉｎ。６．

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