SN-T 4405-2015 黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４４０５—２０１５黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆狌犮狌犿犫犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊２０１５１２０４发布２０１６０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑耘、卢小雨、张伟锋、向才玉、王红英、龙海、潘广、胡运发、李彬、孔德英。 Ⅰ犛犖／犜４４０５—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法１　范围本标准规定了黄瓜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、ＲＴ  ＰＣＲ检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物种子苗木等繁殖材料和植物产品中黄瓜花叶病毒的检疫鉴定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ１８４０　植物病毒免疫电镜检测方法ＳＮ／Ｔ２１２２　进出境植物及植物产品检疫抽样３　基本信息学名：犆狌犮狌犿犫犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊缩写：ＣＭＶ分类地位：雀麦花叶病毒科（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）；黄瓜花叶病毒属（犆狌犮狌犿狅狏犻狉狌狊）。其他信息参见附录Ａ。４　原理和方法依据ＣＭＶ鉴别寄主的症状、病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。５　仪器设备、用具及设施５．１　仪器设备天平（感量，１／１００００ｇ）、ｐＨ计、酶标仪、透射电子显微镜、ＰＣＲ仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、高速离心机、超低温冰箱等。５．２　用具微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等。５．３　设施植物隔离检疫温室。６　试剂ＤＡＳ  ＥＬＩＳＡ检测试剂（见附录Ｂ）、ＲＴ  ＰＣＲ检测试剂（见附录Ｃ）、生物学测定试剂（见８．４）。免疫１犛犖／犜４４０５—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.电镜检测试剂按照ＳＮ／Ｔ１８４０的规定执行。７　样品制备７．１　种子类抽样按照ＳＮ／Ｔ２１２２的规定执行。将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于２５℃左右生长并进行症状观察。待长出３片～４片真叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（１０株为１组）并编号。７．２　苗木类抽样ＳＮ／Ｔ２１２２规定抽样。将苗木种植于隔离温室中，于２５℃左右生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同７．１。８　检测方法８．１　犇犃犛  犈犔犐犛犃检测方法见附录Ｂ。８．２　免疫电镜检测按照ＳＮ／Ｔ１８４０的规定执行。８．３　犚犜  犘犆犚检测方法见附录Ｃ。８．４　生物学测定８．４．１　接种病叶加１∶１（质量∶体积）的磷酸盐缓冲液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．２）于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。８．４．２　鉴别寄主症状苋色藜（犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犪犿犪狉犪狀狋犻犮狅犾狅狉）：褪绿或坏死斑，无系统症状。黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）：绿色或黄绿色系统花叶。昆诺藜（犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿狇狌犻狀狅犪）：褪绿或坏死斑，无系统症状。番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）：系统花叶，叶片变窄。克利夫兰烟（犖犻犮狅狋犻犪狀犪犮犾犲狏犲犾犪狀犱犻犻）：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成绿色或黄绿色系统花叶或环斑。心叶烟（犖犻犮狅狋犻犪狀犪犵犾狌狋犻狀狅狊犪）：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成绿色或黄绿色系统花叶或环斑。烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成系统花叶或畸形。菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊）：冬季表现细小的坏死斑，但夏季无症状表现；无系统症状。２犛犖／犜４４０５—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.９　结果判定ＤＡＳ  ＥＬＩＳＡ检测为阳性后，ＲＴ  ＰＣＲ，或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出黄瓜花叶病毒。如果上述方法还不能判定检测结果，可进行生物学测定，并进行复验。若ＤＡＳ  ＥＬＩＳＡ检测为阴性，则判定为未检出该病毒。１０　样品和记录保存１０．１　样品保存经检测确定携带ＣＭＶ的样品在合适的条件下保存。种子保存在４℃，病株在－２０℃或者－７０℃冰箱中保存，提取的ＲＮＡ样品若需长期保存应放置于－７０℃冰箱。做好标记和登记工作。１０．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。ＤＡＳ  ＥＬＩＳＡ检测需有试验的原始数据，ＲＴ  ＰＣＲ检测需有电泳结果，免疫电镜观察需有病毒粒体照片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。３犛犖／犜４４０５—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）生物学特性犃．１　粒体形态黄瓜花叶病毒粒子为等轴对称的２０面体的球状结构，无包膜，直径约２９．３ｎｍ。犃．２　基因组基因组由三条线形正义单链ＲＮＡ组成，ＲＮＡ１和ＲＮＡ２编码病毒的非结构蛋白，与病毒的复制有关，ＲＮＡ３编码病毒的运动蛋白和外壳蛋白，基因组大小分别为３３５７ｎｔ、３０５０ｎｔ和２２１８ｎｔ，沉降系数９８Ｓ，Ａ２６０／２８０的比值为１．６５，ＲＮＡ占粒体重的１８％。一些ＣＭＶ株系可以携带卫星ＲＮＡ。犃．３　寄主范围ＣＭＶ寄主范围广泛，可侵染８５科３６５属１０００多种双子叶植物和单子叶植物，是禾谷类作物、牧草、木本和草本观赏植物、蔬菜及果树上发生最广，危害最大的病毒。犃．４　病害症状ＣＭＶ幼苗期染病，子叶变黄枯萎，真叶表现出叶色深浅相间的花叶症状。成株期染病，症状在新出幼叶上表现最为明显，老熟叶片症状不明显。表现为在新出叶片上出现黄绿相间的花叶症状，叶片成熟后叶小，皱缩，边缘卷曲。果实上表现为瓜条出现深浅绿色相间的花斑，染病后瓜条生长缓慢甚至停止，果表畸形。发病严重时，植株矮小，茎节间缩短，使植株萎蔫。ＣＭＶ侵染黄瓜后，表现深绿与浅绿相间疣状斑块，果面凹凸不平或畸形；重病株节间短缩，簇生小叶，不结瓜，最后萎缩枯死；ＣＭＶ侵染辣椒后产生花叶、蕨叶、环斑或全株矮化等症状。犃．５　分布地区ＣＭＶ属世界性分布，尤其是在温带地区。犃．６　传播方式犃．６．１　近距离传播ＣＭＶ在田间主要通过蚜虫以非持久性传毒方式传播该病毒，机械摩擦、种子、菟丝子传播也能传播该病毒。犃．６．２　远距离传播ＣＭＶ通过带毒种子、苗木、组培苗等繁殖材料的运输发生远距离传播。４犛犖／犜４４０５—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犅（规范性附录）犇犃犛  犈犔犐犛犃检测犅．１　试剂犅．１．１　包被缓冲液（狆犎９．６）将碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３）１．５９ｇ、碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ定容于１０００ｍＬ蒸馏水中，用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ值至９．６，并储存于４℃。犅．１．２　磷酸盐缓冲液（犘犅犛，狆犎７．４）将氯化钠（ＮａＣｌ）８ｇ、磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ、磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．１５ｇ、氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ溶解于９００ｍＬ蒸馏水，用浓ＨＣｌ调节ｐＨ值到７．４，加水定容至１Ｌ。犅．１．３　犘犅犛犜缓冲液将氯化钠（Ｎａ