SN-T 4344-2015 杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４３４４—２０１５杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犃狆狉犻犮狅狋犮犺犾狅狉狅狋犻犮犾犲犪犳狉狅犾犾狆犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪２０１５０９０２发布２０１６０４０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准起草人：黄新、侯立华、郭欣硕、牟海青、赵文军、张琪、张琰、朱水芳、王有福。 Ⅰ犛犖／犜４３４４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法１　范围本标准规定了杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境杏、桃及李子苗木中杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定。２　杏褪绿卷叶植原体基本信息学名：Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ犘犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪狆狉狌狀狅狉狌犿异名：Ａｐｒｉｃｏｔｃｈｌｏｒｏｔｉｃｌｅａｆｒｏｌｌｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ；Ｅｕｒｏｐｅａｎｓｔｏｎｅｆｒｕｉｔｙｅｌｌｏｗｓｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ；Ａｐｒｉｃｏｔｃｈｌｏｒｏｔｉｃｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｒｕｓ；Ｐｅａｃｈｃｈｌｏｒｏｔｉｃｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｒｕｓ分类地位：软壁菌门，柔膜菌纲，无胆甾原体目，无胆甾原体科，植原体候选属，１６ＳｒＸ  Ｂ植原体组。传播途径：田间近距离扩散以媒介叶蝉（Ｆｉｅｂｅｒｉｅｌｌａｆｌｏｒｉｉ）和嫁接传播为主，远距离以无症带菌苗木传播为主。杏褪绿卷叶植原体的其他信息参见附录Ａ。３　方法原理杏褪绿卷叶植原体的生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据，ＤＡＰＩ荧光染色法和透射电子显微镜法在本标准中作为一种初步筛选植原体的方法；ＰＣＲ技术与ＲＦＬＰ技术结合作为鉴定杏褪绿卷叶植原体的准确方法。４　仪器设备和主要试剂４．１　仪器设备ＰＣＲ仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、透射电子显微镜、荧光显微镜。４．２　主要试剂植原体细胞富集缓冲液（１００ｍＬ）：无水磷酸氢二钾１．６７ｇ，磷酸二氢钾０．４１ｇ，蔗糖１０ｇ，牛血清白蛋白０．１５ｇ，聚乙烯吡咯烷酮２ｇ，维生素Ｃ０．５３ｇ，用５ｍｏｌ／Ｌ的ＫＯＨ调节ｐＨ值至７．６。ＤＮＡ提取缓冲液：２％十六烷基三甲基溴化铵（５０℃左右溶解），１．４ｍｏｌ／Ｌ氯化钠，２０ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。５　病菌的鉴定５．１　症状检查仔细观察寄主植物种苗、叶片等，感病植株典型症状是卷叶，叶片沿着从叶柄到叶尖的直线卷曲，叶１犛犖／犜４３４４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.片脉间失绿，不规则或形成圆锥形或多角形轮廓。症状描述参见附录Ａ。５．２　犇犃犘犐染色选取幼嫩组织（叶脉、侧芽），切片，用１μｇ／ｍＬＤＡＰＩ溶液（４’ ，６ 二脒基 ２ 苯基吲哚）染色，在４６０ｎｍ激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。５．３　通用引物犘犆犚凝胶电泳及犚犉犔犘检测按附录Ｂ提取ＤＮＡ。通用引物ＰＣＲ凝胶电泳及ＲＦＬＰ检测见附录Ｃ。５．４　特异性引物犘犆犚凝胶电泳检测特异性引物ＰＣＲ凝胶电泳检测见附录Ｄ。５．５　植原体形态观察对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察植原体形态方法（见附录Ｅ）。６　结果判定６．１　表现症状与Ａ．２描述一致，并且ＤＡＰＩ染色观察结果显示蓝色荧光或者电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定为植原体。６．２　在５．３检测中，若ＰＣＲ产物凝胶电泳检测结果为阳性，而且ＲＦＬＰ分析片段大小与描述相符，可判定该样品携带１６ＳｒＸ组的植原体。６．３　在５．４检测中，若通过ＥＣＡ  Ｆ、ＥＣＡ  Ｒ引物ＰＣＲ扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，在２３７ｂｐ处检测到特异性扩增条带，可判定该样品携带杏褪绿卷叶植原体。７　样品保存７．１　样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出杏褪绿卷叶植原体的样品应保存于－２０℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。７．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。ＰＣＲ凝胶电泳检测需有电泳结果照片。７．３　复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。２犛犖／犜４３４４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）杏褪绿卷叶植原体其他相关信息犃．１　形态特征形态为杆状或者球形颗粒，是在大小和形态上可变的多形性结构。犃．２　症状特征感病植株典型症状是卷叶，叶片沿着从叶柄到叶尖的直线卷曲，叶片脉间失绿，不规则或形成圆锥形或多角形轮廓。该病原物也能侵染李树，症状与感病杏树相似但不典型，叶片小、红色，形成圆柱状卷曲。犃．３　寄主范围寄主主要是杏、桃和李子，此外，也能寄生在一些杂草如田旋花和狗牙根自然寄主上。犃．４　分布除了在南非未经证实外，杏褪绿卷叶植原体在欧洲被发现。法国（杏栽培地区普遍存在）、德国、希腊、意大利、匈牙利、罗马尼亚、西班牙、瑞士等均有分布。３犛犖／犜４３４４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犅（规范性附录）植原体犇犖犃的提取犅．１　植原体细胞的富集称取新鲜样品叶中脉１．５ｇ，加入７ｍＬ～８ｍＬ新制备的提取缓冲液，５０ｍｇ的石英砂，于研钵中研磨。冰上放置１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ，加入５ｍＬ相同的缓冲液并摇晃均匀；将悬浊液转移至１５ｍＬ离心管，５０００ｒ／ｍｉｎ，使用预冷的离心转头（ＢｅｃｋｍａｎＪＡ２０）４℃离心５ｍｉｎ，将上清液移至另一个离心管中，１９０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，干燥沉淀并用６０℃预热的２ｍＬ２％ＣＴＡＢ溶液，重悬沉淀；６０℃水浴中温浴１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ，将１ｍＬ的溶液转至干净的２ｍＬ的微管中，用于接下来的ＤＮＡ提取。犅．２　犇犖犃提取将１ｍＬ植原体细胞富集液转移至２ｍＬ离心管。加入１ｍＬＤＮＡ提取缓冲液；将离心管置于６５℃水浴中温浴１ｈ～１．５ｈ，每隔２０ｍｉｎ左右将离心管颠倒混匀；２０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心２ｍｉｎ；将离心后的上清液转移至一个新的离心管中，加入三氯甲烷／异戊醇（２４／１）１ｍＬ，混匀，形成乳浊液；将乳浊液在１３０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心５ｍｉｎ；将上清液转入新管，加入ＲＮａｓｅ２ μＬ，３７℃温浴３０ｍｉｎ；加入三氯甲烷／异戊醇（２４／１）１ｍＬ，１３０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心５ｍｉｎ；上清液转入新管，加入８００μＬ预冷的异丙醇，１３０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心１０ｍｉｎ；弃上清液，加入５００μＬ的７０％的乙醇，在１３０００ｒ／ｍｉｎ，４ ℃离心５ｍｉｎ；弃掉上清液，干燥沉淀，加入１００μＬ的灭菌蒸馏水溶解。其他的ＤＮＡ提取方法也可以借鉴，也可以选择使用商业ＤＮＡ提取试剂盒，提取的ＤＮＡ在－８０℃的条件下可以冻存一年。４犛犖／犜４３４４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犆（规范性附录）通用引物犘犆犚扩增以及犚犉犔犘分析犆．１　引物序列植原体通用引物：Ｐ１：５ ′  ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ