SN-T 3971-2014 小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜３９７１—２０１４小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法犐犿犿狌狀狅犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺犻犮犪狊狊犪狔狅犳犮狅犾犾狅犻犱犪犾犵狅犾犱犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犲狊狋犲犱犲狊狆犲狋犻狋狊狉狌犿犻狀犪狀狋狊２０１４０７１４发布２０１５０３０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国西藏出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨俊兴、刘忠清、杨云庆、赤列加措、花群义、吕建强、祝贺、孙洁、艾军、唐金明。 Ⅰ犛犖／犜３９７１—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法１　范围本标准规定了小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法。本标准适用于小反刍兽疫抗体的快速检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ２１２３　出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＳＡ：牛血清白蛋白ＩＣＳ：免疫层析试纸ＰＢＳ：磷酸缓冲液ＰＰＲ：小反刍兽疫ＰＰＲＶ：小反刍兽疫病毒ＳＰＧ：链球菌Ｇ蛋白４　主要设备４．１　恒温箱。４．２　电子天平：精确值０．０００１ｇ。４．３　台式冷冻离心机：最大离心力１５０００犵。４．４　ｐＨ计。４．５　试纸喷膜仪。４．６　试纸条切割机：可连续切割出２ｍｍ～５ｍｍ宽试纸。５　主要试剂和材料除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。试验用水为符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定的三级水。５．１　１％氯金酸溶液（ＡｕＣｌ３·ＨＣｌ·３Ｈ２Ｏ）。５．２　ＰＢＳ：配方见附录Ａ。５．３　ＰＰＲＶＮ蛋白：为基因工程表达蛋白抗原。５．４　链球菌Ｇ蛋白（ＳＰＧ）。１犛犖／犜３９７１—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．５　１％柠檬酸钠溶液。５．６　１％碳酸钾溶液（Ｋ２ＣＯ３）：配方见附录Ａ。５．７　抗ＳＰＧ多克隆抗体。５．８　牛血清白蛋白。５．９　硝酸纤维素膜。５．１０　玻璃纤维棉纸。５．１１　干燥剂。５．１２　ＰＰＲＶ阳性血清，由指定单位提供。５．１３　ＰＰＲＶ阴性血清，由指定单位提供。６　检测原理将胶体金标记的ＳＰＧ固定于金标垫，检测线为纯化的ＰＰＲＶＮ蛋白，对照线为兔抗ＳＰＧ。检测时，阳性样品中的抗ＰＰＲＶ抗体与胶体金标记ＳＰＧ特异性地结合，在ＮＣ膜上移动时，被检测线上的ＰＰＲＶＮ蛋白捕获，胶体金颗粒聚集于此，形成红色的条带，即检测线。相反，阴性样品中不含抗ＰＰＲＶ抗体，在检测线处不形成红色条带。对照线试剂兔抗ＳＰＧ与胶体金标记ＳＰＧ结合，捕获金标复合物，形成对照线。７　免疫胶体金试纸卡的组装７．１　金标犛犘犌及金标垫的制备首先用１％碳酸钠溶液调胶体金溶液的ｐＨ值为６．５，向５０ｍＬ胶体金溶液中缓慢地加入适量ＳＰＧ溶液，室温搅拌３０ｍｉｎ，缓慢加入１０％ＢＳＡ至其终浓度为１％（质量浓度），继续搅拌３０ｍｉｎ。４ ℃４０００犵离心１０ｍｉｎ，将上清转移至另一离心管中，４℃１２０００犵离心３０ｍｉｎ，小心弃去上清。用５ｍＬ（即１／１０原体积）ＰＢＳ（ｐＨ７．０）重悬沉淀。加入１％（质量浓度）的叠氮钠（ＮａＮ３）溶液至终浓度为０．０２％，用试纸喷膜仪将胶体金溶液喷于３００×５ｍｍ玻璃纤维棉上，速度为５０μＬ／ｃｍ，并于４℃真空抽干，于４℃干燥保存备用。７．２　检测线和对照线的制备用纯化的浓度为２ｍｇ／ｍＬ的ＰＰＲＶＮ蛋白和兔抗ＳＰＧＩｇＧ分别作为检测线和对照线试剂。用试纸喷膜仪将两种试剂分别点在硝酸纤维膜上，点样速度为０．７５μＬ／ｃｍ。３７℃干燥２ｈ，４℃密封保存备用。７．３　试纸卡的组装按图Ｂ．１所示，将背衬、样品垫、吸水垫、硝酸纤维膜、金标垫粘在一起，并用试纸条切割机将其切成３．５ｍｍ宽的试纸条，将试纸条放入试纸卡中，将试纸卡放入含有干燥剂的密封袋内，密封后于２℃～８℃保存备用。８　样品采集、处理和保存采集动物血样，室温静置约３０ｍｉｎ，使血液自然凝固。５０００犵离心１０ｍｉｎ，收集上清液转移至另一离心管中，于５６℃水浴中作用３０ｍｉｎ后，待血清样品恢复室温后用于检测。血清样品也可放４℃暂时保存（不超过７ｄ）或－７０℃长期保存。样品的运输按ＳＮ／Ｔ２１２３执行。２犛犖／犜３９７１—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.９　样品检测９．１　从２℃～８℃冰箱中取出带包装的试纸卡，在室温放置约３０ｍｉｎ。９．２　样品稀释，分别用样品稀释液（见附录Ａ）将ＰＰＲＶ阳性血清、ＰＰＲＶ阴性血清和待检血清样品稀释５倍，即向８０μＬ稀释液加入２０μＬ血清，用加样器混匀。９．３　打开试纸卡的密封包装袋，检查试纸卡是否正常。如试纸条已变形、变色或受潮则不能使用。９．４　将试纸卡平放于操作台面，加样孔朝上，向加样孔中加入约１００μＬ５倍稀释的血清样品，室温静置５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。整个检测过程在室温（２０℃～２５℃）进行。１０　结果判定１０．１　根据图Ｂ．２所示进行结果判定，如果对照线和检测线均显色，则为阳性；如果仅对照线显色，而检测线不显色，则为阴性；如果对照线不显色，则检测无效，应换用另一根试纸卡再次检测。１０．２　结果判定应在加样后２０ｍｉｎ内进行。１１　商品化试纸卡检测可使用等效商品化胶体金试纸卡检测ＰＰＲＶ血清抗体，按相关说明书进行检测和结果判定。３犛犖／犜３９７１—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（规范性附录）试剂配制犃．１　磷酸缓冲液（犘犅犛）氯化钠（ＮａＣｌ）　　　　　　　　　　８ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）２．９ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．２　１％柠檬酸钠溶液取柠檬酸三钠１ｇ，加入１００ｍＬ蒸馏水中，充分振荡，使其完全溶解，并用０．２２μｍ滤膜过滤。该溶液需现用现配。犃．３　１％碳酸钾溶液取柠碳酸钾１ｇ，加入１００ｍＬ蒸馏水中，充分振荡，使其完全溶解，并用０．２２μｍ滤膜过滤。该溶液需现用现配。犃．４　１０％犅犛犃溶液取１ｇＢＳＡ粉末，加入１０ｍＬ蒸馏水，充分振荡使其全部溶解，并用０．２２μｍ滤膜过滤。分装成１ｍＬ／管，于－７０℃保存备用。犃．５　胶体金溶液的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。向９９ｍＬ蒸馏水中加入１ｍＬ１％氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入２．４ｍＬ新鲜配制的１％（质量浓度）柠檬酸三钠溶液，并充分混匀，继续加热约５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，溶液颜色由蓝色变为红色即可。冷却至室温后，用０．２２μｍ滤膜过滤，分装后４℃避光保存备用。犃．６　样品稀释液（含有０．５％犅犛犃的犘犅犛）向１００ｍＬＰＢＳ（见Ａ．１）中加入０．５ｇＢＳＡ粉剂，混匀。４犛犖／犜３９７１—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犅（规范性附录）试纸条结构示意图和结果判定方法图图犅．１　小反刍兽疫胶体金试纸结构示意图　　　　　　　　　　　　　　　犪）　阳性　　犫）　阴性　　犮）　无效　　犱）　无效图犅．２　小反刍兽疫胶体金试纸卡检测结果判定示意图５犛犖／犜３９７１—２０１４ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书４１０２—１７９３犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法ＳＮ／Ｔ３９７１—２０１４ 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平