SN-T 1617-2017 可可肿枝病毒检疫鉴定方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１６１７—２０１７代替ＳＮ／Ｔ１６１７—２００５可可肿枝病毒检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犪犮犪狅狊狑狅犾犾犲狀狊犺狅狅狋狏犻狉狌狊２０１７０７２１发布２０１８０３０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１６１７—２００５《可可肿枝病毒检测方法》，与ＳＮ／Ｔ１６１７—２００５相比，主要技术变化如下： — — —完善了原标准的检测方法，增加实时荧光ＰＣＲ检测方法； — — —完善了原标准的基因组内容； — — —删除了原标准中的免疫诱捕ＰＣＲ方法，增加了ＰＣＲ方法； — — —修改了原标准中结果判断； — — —修改了原标准中附录。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国中山出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：魏梅生、陈定虎、相宁、李桂芬、吴翠萍、郭京泽。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： — — —ＳＮ／Ｔ１６１７—２００５。 Ⅰ犛犖／犜１６１７—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.可可肿枝病毒检疫鉴定方法１　范围本标准规定了可可肿枝病毒的检测方法。本标准适用于进境植物材料中可可肿枝病毒的检疫检测。２　可可肿枝病毒基本信息学名：犆犪犮犪狅狊狑狅犾犾犲狀狊犺狅狅狋狏犻狉狌狊缩写：ＣＳＳＶ中文名：可可肿枝病毒异名：犜犺犲狅犫狉狅犿犪ｖｉｒｕｓ１；犕犪狉犿狅狉狋犺犲狅犫狉狅犿犪犲；犜犺犲狅犫狉狅犿犪狏犻狉狌狊犻狀犳犾犪狀狊。分类地位：花椰菜花叶病毒科（犆犪狌犾犻犿狅狏犻狉犻犱犪犲）；杆菌状ＤＮＡ病毒属（犅犪犱狀犪狏犻狉狌狊）。ＣＳＳＶ的其他信息参见附录Ａ。３　方法原理ＣＳＳＶ的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据ＣＳＳＶ与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ＤＡＳ  ＥＬＩＳＡ）；依据ＣＳＳＶ的基因组特征建立ＰＣＲ、实时荧光ＰＣＲ；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有ＣＳＳＶ。４　仪器、用具及试剂４．１　仪器设备酶联检测仪、天平（感量０．００１ｇ）、ＰＣＲ仪、电泳仪、实时荧光ＰＣＲ仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。４．２　用具可调移液器（２００μＬ、２０μＬ、２μＬ）、可调移液器头、酶联板、离心管、指型管、研钵等。４．３　试剂酶联测定试剂（见附录Ｂ）、聚合酶链式反应检测试剂（见附录Ｃ）。５　检测方法５．１　双抗体夹心酶联免疫吸附测定见附录Ｂ。１犛犖／犜１６１７—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．２　聚合酶链式反应（犘犆犚）检测见附录Ｃ。５．３　实时荧光犘犆犚检测见附录Ｄ。５．４　生物学测定参见附录Ｅ。６　结果判定样品检测流程及结果判定按下述原则进行。 — — —若ＤＡＳ  ＥＬＩＳＡ检测结果为阳性时：ＰＣＲ的检测结果为阳性，则判定样品携带ＣＳＳＶ；或采用实时荧光ＰＣＲ进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带ＣＳＳＶ。 — — —若ＤＡＳ  ＥＬＩＳＡ检测结果为阴性时：ＰＣＲ的检测结果为阴性，则判定样品不携带ＣＳＳＶ；检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为ＣＳＳＶ序列，则判定样品携带ＣＳＳＶ。必要时可进行生物学传毒测定，并进行复验。７　样品保存与复核７．１　样品保存鉴于可可肿枝病毒为检疫性有害生物，应做好以下准备，并在一周内接受复核。病毒要有活体样品存在，其他样品应妥善保存于－８０℃冰箱中，以备复核。７．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，酶联测定需有酶联板反应的照片和原始数据，ＰＣＲ检测需有电泳结果照片，实时荧光ＰＣＲ检测应有荧光曲线图。７．３　复核由指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。２犛犖／犜１６１７—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）可可肿枝病毒其他信息犃．１　寄主范围重要的自然寄主有可可（犜犺犲狅犫狉狅犿犪犮犪犮犪狅）、厚皮可乐果（犆狅犾犪犮犺犾犪犿狔犱犪狀狋犺犪）、吉贝（犆犲犻犫犪狆犲狀  狋犪狀犱狉犪）大可乐果变近无毛变种（犆狅犾犪犵犻犵犪狀狋犲犪狀ｖａｒ．犵犾犪犫狉犲狊犮犲狀狊）和一种苹婆属植物犛狋犲狉犮狌犾犻犪狋狉犪犵犪 犮犪狀狋犺犪。人工接种还可侵染木棉科（Ｂｏｍｂａｃａｃｅａｅ）、椴树科（Ｔｉｌｉａｃｉａｅ）、梧桐科（Ｓｔｅｒｃｕｌｉａｃｅａｅ）、锦葵科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）等３０种植物，其中猴面包树（犃犱犪狀狊狀犻犪犱犻犵犻狋犪狋犪）和犆狅犾犪犮狅狉犱犻犳狅犾犻犪易感病。犃．２　病害症状犃．２．１　肿枝生长较快的枝条节、节间和末梢发生肿大，一些分离物还能使根部，特别是根尖产生肿大，有时侧根坏死。肿茎和肿根症状中，次生木质部和韧皮部都有所增加，但木质部不发生坏死。犃．２．２　叶片叶片上的症状最初表现出明脉，形成网纹状，接着沿叶脉变红，随着叶片变绿而坚硬，红脉逐渐消火，有的叶片则产生褪绿，叶片褪绿斑部分组织不分化，其中有小型退化的叶绿体，细胞间隙缩小。犃．２．３　果实幼嫩的果荚，形成墨绿或浅绿的斑驳，后期则发展成深红色大理石状纹。受侵果荚呈圆形比正常的果荚小，其中可可豆的重量只有健康的一半，可可豆比正常的要扁平，子叶呈灰白色。犃．３　分布分布于加纳、科特迪瓦、尼日利亚、多哥、塞拉利昂、斯里兰卡、印度尼西亚。犃．４　传播途径可可肿枝病毒可通过嫁接、机械接种和多种粉蚧传播。在自然状况下，ＣＳＳＶ主要通过粉蚧来传播，粉蚧传播最主要的种有尼兰粉蚧（犘犾犪狀狅犮狅犮犮狅犻犱犲狊狀犼犪犾犲狀狊犻狊）、肯尼亚咖啡粉蚧（犘犾犪狀狅犮狅犮犮狌狊犽犲狀狔犪犲）、橘粉蚧（犘犾犪狀狅犮狅犮犮狌狊犮犻狋狉犻）和热带弗氏粉蚧（犉犲狉狉犻狊犻犪狏犻狉犵犪狋犪）。若虫和雌成虫是有效的传毒介体，但雄成虫不传播病毒，粉蚧的传毒机制比较接近于半持久性，但尼兰粉蚧若虫在饲毒后蜕皮仍有保毒能力。犃．５　粒体形态可可肿枝病毒粒体杆菌状，长度为１２１ｎｍ～１３０ｎｍ，宽为２８ｎｍ。３犛犖／犜１６１７—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.犃．６　基因组病毒基因组为双链环状ＤＮＡ，有２个不连续区，基因组全序列为７００６ｂｐ～７２９７ｂｐ。具有５个开放式阅读框架（ＯＲＦ），分别为ＯＲＦＩ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦＸ和ＯＲＦＹ。它们分别编码１６．７ｋＤａ蛋白、１４．４ｋＤａ核酸结合蛋白、２１１ｋＤａ多聚蛋白（细胞间移动蛋白、外壳蛋白的ＲＮＡ结合区域、天冬氨酰蛋白酶、反转录酶、核糖核酸酶Ｈ）、１３ｋＤａ和１４ｋＤａ蛋白。４犛犖／犜１６１７—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犅（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定犅．１　试材犅．１．１　酶联板的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。犅．１．２　包被抗体特异性的可可肿枝病毒抗体。犅．１．３　酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的可可肿枝病毒抗体。犅．１．４　底物对硝基苯磷酸二钠