以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1556 —2020 代替 SN/T 1556— 2005 鸡传染性鼻炎检疫技术规范 Quarantine protocol for chicken infectious coryza 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 11.220 CSS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 1556—2020I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件代替 SN/T 1556— 2005《鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验操作规程》 。本文件与 SN/T 1556— 2005 相比，主要技术变化如下：——增加了临床诊断方法；——增加了病原分离鉴定方法；——增加了 PCR 检测方法；——增加了血凝抑制试验（HI） ； ——增加了间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA） 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：陶虹、孙洁、张彩虹、林彦星、杨俊兴、林庆燕、秦智锋、刘建利、唐金 明、陈书琨、廖立珊、曹琛福、吕建强、花群义。 本文件所代替文件的历次版本发布情况为：—— SN/T 1556— 2005。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 1556—2020鸡传染性鼻炎检疫技术规范 1 范围 本文件规定了鸡传染性鼻炎病原分离鉴定方法、聚合酶链式反应技术以及血清平板凝集试验、血 凝抑制试验、间接酶联免疫吸附试验、鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验的操作方法。 本文件适用于鸡传染性鼻炎的诊断和检疫。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4　诊断技术 4.1 临床综合诊断 鸡传染性鼻炎的临床症状及病理变化参见附录 A。 4.2 病原分离鉴定 4.2.1 试剂与材料 4.2.1.1 灭菌棉拭子、鲜血琼脂平皿、灭菌小瓶、过氧化氢酶。 4.2.1.2 产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（或辅酶 1，NAD）表皮葡萄球菌。 4.2.1.3 5% 的二氧化碳（CO2）培养箱、4 ℃或 -20 ℃~-30 ℃冰箱。 4.2.2 样品的采集和处理 样品的采集、保存及运输应符合 GB/T 18088 和 SN/T 2123 的相关采样要求。 无菌采集发病鸡血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4 ℃ 或 -20 ℃~ -30 ℃冰箱保存或冷藏条件下立即送检。 无菌采集处于急性发病阶段（潜伏期 1 d~7 d）的病鸡眶下窦内的黏液、浆液，或气管和气囊分泌 物用于病原学诊断，其中眶下窦腔的细菌最为纯净。以正式出版文本为准2 SN/T 1556—20204.2.3 细菌的分离鉴定 无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中黏液或浆液。用棉拭子在鲜血琼脂平皿上横 向划线 5 ~7 条，然后取产 NAD 表皮葡萄球菌从横线中间划一纵线。将划种好的平皿置于 5% 的二氧化 碳培养箱中 37 ℃培养 18 h~ 24 h，观察菌落特点。取可疑菌落的纯化物做过氧化氢酶试验，如有大量 气泡者为过氧化氢酶阳性反应。也可采用 PCR 鉴定可疑菌落，同时取病料或可疑菌落进行动物试验， 方法见附录 B。 4.2.4 结果判定 若鲜血琼脂培养基上出现“卫星样”生长的露滴状、针头大小的小菌落，即靠近产 NAD 表皮葡萄 球菌线处菌落较大，直径可达 0. 3 mm，离产 NAD 表皮葡萄球菌线越远，菌落越小，过氧化氢酶阴性， 结果判为阳性；若无卫星现象，但有露滴状、针头大小的小菌落出现且过氧化氢酶阴性，则仍需采用PCR 或动物试验鉴定，以避免漏检不需 NAD 的副鸡禽杆菌。若无上述现象，则判为阴性。 4.3 PCR 检测 4.3.1 试剂与材料 4.3.1.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 4.3.1.2 0.5% Np-40（乙基苯基聚乙二醇） 、0.5% 吐温 -20、100 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl、0.2 mg/mL 蛋 白酶 K、阴阳性对照物。 4.3.1.3 生理盐水、蒸馏水、1.5 mL 及 0.5 mL 小离心管、吸头，均灭菌处理。 4.3.1.4 PCR 仪、水浴锅、小型离心机、微量加样器、冰块。 4.3.1.5 琼脂糖、电泳仪、水平电泳槽、紫外灯或凝胶成像仪。 4.3.1.6 10 mg/mL 溴化乙锭、加样缓冲液、TAE 电泳缓冲液。 4.3.2 实验操作 4.3.2.1 核酸抽提 4.3.2.1.1 组织样品的核酸提取 无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中的黏液或浆液浸入含 0.8 mL ~1.0 mL 生理盐水 的 1.5 mL 离心管内，室温放置 0.5 h 后，将棉拭子在管壁上尽量挤干，然后弃至废液缸中。 将浸过棉拭子的离心管以 8 000 r/min ~10 000 r/min 离心 10 min，小心吸去大部分上清液，保留 20 µL 左右液体。 用吸头将离心管中沉淀物与剩余液体混合均匀，加入 15 µL 1× PCR 缓冲液（其中含 0.5% Np-40， 0.5% 吐温 -20，0.2 mg/mL 蛋白酶 K 和 100 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl） ，压紧离心管盖，约 50 ℃水浴 1 h， 然后 95 ℃ 10 min，再冰浴 10 min 后进行 PCR 扩增或置 -20 ℃保存。 4.3.2.1.2 菌落的核酸提取 挑取于 5% 的二氧化碳培养箱中 37 ℃培养 18 h~ 24 h 的菌落，加到含 10 µL 蒸馏水的 0.5 mL 的小 离心管中，压紧管盖，95 ℃加热 10 min，再冰浴 10 min 后进行 PCR 扩增或 -20 ℃保存。 用 10 µL 无菌水作为阴性对照样品，用 9 µL 无菌水加 1 µL 已知阳性对照物作为阳性对照样品。约 50 ℃水浴 1 h，然后 95 ℃ 10 min，再冰浴 10 min 后进行 PCR 扩增或置 -20 ℃保存。 4.3.2.1.3 其他核酸提取方法 可采用等效的商品化试剂盒进行细菌病原核酸提取。以正式出版文本为准3 SN/T 1556—20204.3.2.2 PCR 扩增 针对副鸡禽杆菌 hagA 基因设计 PCR 检测引物： 上游引物 P1 ：5 ’－ tgagggtagtcttgcacgcgaat － 3 ’ 下游引物 P2 ：5 ’－ caaggtatcgatcgtctctctact － 3 ’ PCR 反应体系为 25 µL，其中 mix 12.5 µL，ddH2O 5.5 µL，P1 1 µL，P2 1 µL，DNA 模板 5 µL。 反应条件：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。 扩增片段长度 510 bp，扩增序列参见附录 C。 4.3.2.3 电泳 制备 1.2 % 琼脂糖凝胶板。取 5 µL PCR 产物与 2 µL 上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样 孔中。加入分子量标准。盖好电泳仪，插好电极，60 V~ 80 V 稳压电泳，30 min~ 50 min。在紫外线灯下 观察照相存档；或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档。用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。 4.3.2.4 结果判定 试验条件成立判定：阴性对照无目的条带、阳性对照在约 510 bp 处出现一条特异性的扩增条带， 判定试验成立。 检测样品出现一条分子量为 510 bp 条带， 与阳性对照 PCR 产物同步迁移的大小相同条带，判为鸡 传染性鼻炎核酸阳性；检测样品在约 510 bp 处没有任何特异性条带， 与阴性对照相同，判为鸡传染性鼻 炎核酸阴性。 4.4 血清学检测 4.4.1 血清平板凝集试验 4.4.1.1 材料 4.4.1.1.1 鸡传染性鼻炎平板凝集试验抗原、阴性对照血清、阳性对照血清，使用前与被检血清一起 恢复至室温。 4.4.1.1.2 载玻片、微量加样器 1 个、灭菌吸头。 4.4.1.2 操作程序 4.4.1.2.1 本试验在室温（20 ℃~25 ℃）下进行。 4.4.1.2.2 先在玻板背面写好编号，每个样品间至少留 20 mm 空隙，再在每个序号边加抗原 15 µL。 4.4.1.2.3 按玻板上的序号加对照或被检血清 15 µL ，每个血清样品换一个吸头，将血清与抗原混匀， 反应持续 3 min~ 5 min，在此时间内观察结果。每次试验均设阴性、阳性对照。 4.4.1.2.4 在黑色背景或在灯下明亮处观察并记录结果。 4.4.1.3 结果判定与表示方法 血清平板凝集试验判定标准见表 1。以正式出版文本为准4 SN/T 1556—2020表 1 血清平板凝集试验判定标准 编号 反应表现 判定 记录符号