SN-T 1486-2016 输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１４８６—２０１６代替ＳＮ／Ｔ１４８６—２００４输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狔犲犾犾狅狑犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊犻狀犻犿狆狅狉狋犲犱犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊２０１６０３０９发布２０１６１００１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１４８６—２００４《输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１４８６—２００４相比主要技术变化如下： — — —修改了“１　标准的范围 ” ； — — —修改和增加了 “２　规范性引用文件 ” ； — — —增加了术语和定义 “ＲＴ  ＰＣＲ反应” 、 “荧光ＲＴ  ＰＣＲ反应” ； — — —增加了“４　缩略语” ； — — —修改和增加了 “５　实验室生物安全要求 ” ；将“５　实验室生物安全要求 ”调整为“６　生物安全措施” ，并修改了表述内容； — — —修改了结构和表述：划分了层次，分为“主要仪器和设备 ” 、 “主要试剂 ” 、 “检验程序 ” ；将“６．１．１　器材”调整为“７　仪器和设备 ” ，并修改了表述方式和内容；将“６．１．２　常用试剂 ”调整为 “８　主要试剂 ” ，并修改了表述方式和内容； — — —修改了内容和方法：将“６．２　操作方法 ”调整为“９　检验程序 ” ，并修改了表述；增加９．３“荧光ＲＴ  ＰＣＲ检测方法 ” ；删除“病毒分离与酶联免疫吸附试验检测方法 ” ； — — —修改并增加了结果判定的细节：修改了“ＲＴ  ＰＣＲ方法结果的判定 ”的表述；增加了“荧光ＲＴ ＰＣＲ方法结果的判定 ” ； — — —增加了废弃物处理； — — —删除了附录Ａ。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张升、周冬根、吴薇、郑剑宁、杨天赐、崔科军、胡群。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： — — —ＳＮ／Ｔ１４８６—２００４。 Ⅰ犛犖／犜１４８６—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法１　范围本标准规定了国境口岸输入性蚊类携带黄热病毒的检测对象、生物安全措施、仪器和设备、主要试剂、检验程序、阳性结果处置和废弃物的处理。本标准适用于输入性蚊类体内携带黄热病毒的实验室检验。口岸发现的蚊类携带黄热病毒检测可参考本标准执行。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＷＳ２３３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１输入性蚊类　犻犿狆狅狉狋犲犱犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊通过入境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包等携带入境的蚊类。３．２黄热病毒　狔犲犾犾狅狑犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊属于黄病毒科（犉犾犪狏犻狏犻狉犻犱犪犲）黄病毒属（犉犾犪狏犻狏犻狉狌狊）单股正链ＲＮＡ病毒，与同属的登革热病毒等有交叉免疫反应。病毒颗粒为直径３７ｎｍ～５０ｎｍ的球形，外有脂蛋白包膜，包膜表面有刺突。基因组大小约为１１ｋｂ，只含有一个长的开放阅读框架。３．３逆转录聚合酶链式反应　狉犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀（犚犜  犘犆犚）将ＲＮＡ的逆转录（ＲＴ）和ｃＤＮＡ的聚合酶链式扩增（ＰＣＲ）相结合的技术。本标准采用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ  ＰＣＲ）。在ＲＴ  ＰＣＲ中，首先以ＲＮＡ为模板，利用下游特异性引物，在依赖ＲＮＡ的ＤＮＡ聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ），该步称作 “逆转录” ；随后，再以ｃＤＮＡ为模板，利用上游和下游特异性引物，在ＤＮＡ聚合酶的作用下进行ＰＣＲ循环扩增；最终使ＲＮＡ分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。３．４荧光犚犜  犘犆犚反应　犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜  犘犆犚实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ方法有多种，本标准采用的是ＴａｑＭａｎ水解探针法，其原理是在常规ＲＴ  ＰＣＲ的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，利用犜犪狇酶的５ ′→ １犛犖／犜１４８６—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.３ ′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即扩增一条ＤＮＡ链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的积累与ＰＣＲ产物形成完全同步。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ｂｐｂａｓｅｐａｉｒ：碱基对。ＦＡＭ６  ｃａｒｂｏｘｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ：６ 羧基荧光素，一种荧光报告基团。ＢＨＱ１ＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ  １：一种荧光淬灭基团。５　检测对象主要检测的输入性对象包括：伊蚊属埃及伊蚊（犃犲犱犲狊犪犲犵狔狆狋犻）和非洲伊蚊（犃犲犱犲狊犪犳狉犻犮犪狀狌狊），及可能携带黄热病毒的外来输入性蚊种等。６　生物安全措施６．１　检测工作中的个人防护参照ＧＢ１９４８９。６．２　实验室应符合ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３对生物安全２级（ＢＳＬ  ２）实验室的生物安全要求。６．３　使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理。７　仪器和设备本方法使用的主要仪器如下： — — —超净工作台； — — —Ⅱ级生物安全柜； — — —全自动核酸提取仪； — — —实时荧光定量ＰＣＲ仪； — — —ＰＣＲ热循环仪； — — —恒温孵育仪； — — —普通台式离心机； — — —高速冷冻离心机（离心力可达２００００× 犵）； — — —电泳仪； — — —凝胶成像分析系统； — — —体视显微镜； — — —高压灭菌锅； — — —冰箱：４℃、－２０℃和－７０℃； — — —可调式微量加样器（１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）及配套带滤芯吸头。８　主要试剂本方法使用的主要试剂如下：２犛犖／犜１４８６—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.— — —ＲＴ  ＰＣＲ通用试剂：ＱＩＡＧＥＮＯｎｅＳｔｅｐＲＴ  ＰＣＲＫｉｔ试剂盒１）； — — —荧光ＲＴ  ＰＣＲ通用试剂：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｏｂｅＲＴ  ＰＣＲＫｉｔ试剂盒１）； — — —病毒ＲＮＡ提取试剂：ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡｋｉｔ试剂盒１）；１）　给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。— — —１０× ＴＢＥ电泳缓冲液； — — —无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水； — — —ＧｏｌｄｅｎＶｉｅｗ核酸染料：使用浓度为５μＬ／１００ｍＬ； — — —引物和探针：针对黄热病毒核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表１。表１　黄热病毒犚犜  犘犆犚／荧光犚犜  犘犆犚检测的引物和探针引物／探针名称序列（５ ′→３ ′）靶标基因扩增片段大小ＹＦＶ  ＦＰ１ＣＡＡＴＡＡＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＹＦＶ  ＲＰ１ＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＡＡＮＳ５３４９ＹＦＶ  ＦＰ２ＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＹＦＶ  ＲＰ２ＧＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＹＦＶ ｐｒｏｂｅＦＡＭ  ＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴ  Ｂ