SN-T 1460-2015 输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１４６０—２０１５代替ＳＮ／Ｔ１４６０—２００４输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊犳狅狉狑犲狊狋狀犻犾犲狏犻狉狌狊犪狀犱犛狋．犔狅狌犻狊犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犮犪狉狉犻犲犱犫狔犻犿狆狅狉狋犲犱犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊２０１５０９０２发布２０１６０４０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１４６０—２００４《输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１４６０—２００４相比，主要变化如下： — — —增加了规范性引用文件； — — —对生物安全要求进行了修订，删除了在生物安全３级实验室的操作要求，增加了生物安全实验室设计原则、病毒核酸分子检测操作要求、实验室设施和设备，检测工作的安全防护和实验室废弃物处理的要求； — — —对病毒核酸分子检测方法进行了修订，增加了实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ方法； — — —删除了附录Ａ。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑剑宁、胡群、李红、裘炯良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： — — —ＳＮ／Ｔ１４６０—２００４。 Ⅰ犛犖／犜１４６０—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法１　范围本标准规定了国境口岸输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒检测的生物安全要求、检测对象、检测方法、结果的报告。本标准适用于检验检疫机构对输入性蚊类体内携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒检测和报告，对口岸发现的蚊类检测西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒也可参照执行。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＷＳ２３３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１输入性蚊类　犻犿狆狅狉狋犲犱犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊通过入境交通工具、集装箱、货物及行李带入境内的库蚊、伊蚊属蚊类。３．２西尼罗病毒　狑犲狊狋狀犻犾犲狏犻狉狌狊；犠犖犞西尼罗热的病原体，属黄病毒科黄病毒属，为单链ＲＮＡ病毒。西尼罗病毒分两个基因型，导致人类感染西尼罗病毒的分离株主要为 Ⅰ型。主要分布于非洲、中东、西亚和北美。３．３圣路易脑炎病毒　犛狋．犔狌犻狊犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊；犛犔犈犞圣路易脑炎的病原体，属黄病毒科黄病毒属，为单链ＲＮＡ病毒。主要分布于北美洲。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。Ｃｔ值：循环阈值（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）ＤＥＰＣ：焦碳酸二乙酯（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）ＦＡＭ：６ 羧基荧光素（６  ｃａｒｂｏｘｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）１犛犖／犜１４６０—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.ＲＴ  ＰＣＲ：逆转录聚合酶链式反应（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）ＴＡＭＲＡ：四甲基罗丹明（ｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）５　检测对象输入性蚊类。６　生物安全要求实验室及检验应遵照以下生物安全要求：ａ）　生物安全实验室设计原则应遵照ＧＢ１９４８９的规定。ｂ）　实验室设施和设备应遵照ＧＢ１９４８９规定的ＢＳＬ  ２实验室要求。ｃ）　实验室废弃物处理应遵照ＧＢ１９４８９对废物处置的要求。ｄ）　检测工作的安全防护应遵照ＷＳ２３３型规定的二级生物安全个体防护要求。ｅ）　病毒核酸分子检测检测操作要求应遵照相关国家标准的规定。７　病毒核酸分子检测 — — —普通犚犜  犘犆犚方法和实时荧光犚犜  犘犆犚方法７．１　仪器和设备需要如下仪器设备：ａ）　荧光定量ＰＣＲ仪；ｂ）ＰＣＲ仪；ｃ）二级生物安全柜；ｄ）普通冰箱；ｅ）－７０℃超低温冰箱；ｆ）普通台式离心机；ｇ）高速冷冻离心机（离心力可达１２０００犵）；ｈ）微量可调移液器（０．１μＬ～２．５μＬ、１μＬ～２０μＬ、１０μＬ～２００μＬ、２００μＬ～１０００μＬ）；ｉ）涡旋器；ｊ）电泳仪；ｋ）凝胶成像分析系统；ｌ）高压灭菌锅。７．２　主要试剂７．２．１　除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。７．２．２　实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。用于ＰＣＲ（包括核酸抽提）时所用的水应是无ＲＮＡ酶的水。７．２．３　核酸提取试剂为Ｔｒｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂或商品化的病毒ＲＮＡ提取试剂盒。７．２．４　引物和探针为根据表１和表２的序列进行合成引物和探针，加无ＲＮＡ酶的超纯水配制成２０μｍｏｌ／Ｌ的储存液。２犛犖／犜１４６０—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.表１　普通犚犜  犘犆犚检测的引物病毒种类引物扩增片段大小／ｂｐＷＮＶＳＬＥＶ上游引物ＷＮ２３３：５’ ＴＴＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴ  ３ ’ 下游引物ＷＮ６４０ｃ：５’ ＣＡＧＣＣＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＡＣＡＴＴＣＡＴＡ  ３ ’ 上游引物ＳＬＥ７２７：５’ ＧＴＡＧＣＣＧＡＣＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＴＧＴＧＣ  ３ ’ 下游引物ＳＬＥ１１１９ｃ：５’ ＡＣＴＣＧＧＴＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡ  ３ ’４０８３９３表２　实时荧光犚犜  犘犆犚检测的引物和探针病毒种类引物扩增片段大小／ｂｐＷＮＶＳＬＥＶ上游引物ＷＮ１１６０：５’ ＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧ  ３ ’ 下游引物ＷＮ１２０９：５’ ＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＧＴＣＡＴＴＧ  ３ ’ 探针ＷＮＰ：５’ ＦＡＭ  ＴＧＣＣＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣ  ＴＡＭＲＡ  ３ ’ 上游引物ＳＬＥ２４２０：５’ ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＧＧＡＧＧＧＡＴＴＣＴ  ３ ’ 下游引物ＳＬＥ２４８７ｃ：５’ ＴＡＧＧＴＣＡＡＴＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＧ  ３ ’ 探针ＳＬＥＰ：５’ ＦＡＭ  ＴＣＴＧＧＣＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧ  ＴＡＭＲＡ  ３ ’７０６８７．２．５　一步法普通ＲＴ  ＰＣＲ试剂盒采用德国Ｑｉａｇｅｎ公司ＯｎｅＳｔｅｐＲＴ  ＰＣＲｋｉｔ１）。７．２．６　一步法荧光ＲＴ  ＰＣＲ试剂盒采用宝生物工程（大连）有限公司ＯｎｅＳｔｅｐＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ  ＰＣＲＫｉｔ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）１）。７．３　操作方法７．３．１　样品预处理将采集的蚊虫样本，按１只～５只或适量（不超过２０只）为一组，加入１ｍＬ灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆密闭送检，或－７０℃以下保存待检。７．３．２　病毒核酸提取７．３．２．１　犜狉犻狕狅犾法取７．３．１处理好组织匀浆上清液１００μＬ，置于１．５ｍＬ离心管中，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ，再加入２００μＬ三氯甲烷。混匀器上振荡混匀５ｓ或颠倒混匀１５次；１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，吸取上层液体，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置１０ｍｉｎ，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，轻轻倒去上清液；加入７０