SN-T 1135.3-2016 马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１３５．３—２０１６代替ＳＮ／Ｔ１１３５．３ —２００３马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘狅狋犪狋狅犿狅狆 狋狅狆狏犻狉狌狊２０１６１２１２发布２０１７０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ１１３５系列标准共分为１３部分： — — —第１部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法； — — —第２部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法； — — —第３部分：马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法； — — —第４部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法； — — —第５部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法； — — —第６部分：马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法； — — —第７部分：马铃薯Ａ病毒检疫鉴定方法； — — —第８部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法； — — —第９部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法； — — —第１０部分：马铃薯Ｖ病毒检疫鉴定方法； — — —第１１部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法； — — —第１２部分：马铃薯Ｍ病毒检疫鉴定方法； — — —第１３部分：马铃薯Ｙ病毒检疫鉴定方法。本部分为ＳＮ／Ｔ１１３５的第３部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分代替ＳＮ／Ｔ１１３５．３ —２００３《马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法》。本部分与ＳＮ／Ｔ１１３５．３ —２００３相比，主要技术性差异如下： — — —删除了“引言” ； — — —删除了“术语和定义 ”一章； — — —增加了“马铃薯帚顶病毒基本信息 ”一章； — — —删除了“现场检疫与抽样 ”一章； — — —增加了“检测方法 ”一节； — — —修改了ＲＴ  ＰＣＲ检测方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：李明福、张永江、丁小兰、相宁、李桂芬、魏梅生、陈枝楠、黄文胜、张成良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： — — —ＳＮ／Ｔ１１３５．３ —２００３。 Ⅰ犛犖／犜１１３５．３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法１　范围本部分规定了马铃薯帚顶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本部分适用于所有进境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯帚顶病毒的检疫鉴定以及马铃薯帚顶病毒引起病害的田间调查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ１８４０　植物病毒免疫电镜检测方法ＳＮ／Ｔ２１２２　进出境植物及植物产品检疫抽样３　马铃薯帚顶病毒基本信息中文名：马铃薯帚顶病毒学名：犘狅狋犪狋狅犿狅狆 狋狅狆狏犻狉狌狊缩写：ＰＭＴＶ分类地位：帚状病毒科（Ｖｉｒｇａｖｉｒｉｄａｅ）马铃薯帚顶病毒属（犘狅犿狅狏犻狉狌狊）。马铃薯帚顶病毒的其他信息参见附录Ａ。４　方法原理马铃薯帚顶病毒的血清学特性、分子生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据。５　仪器设备、用具及试剂５．１　仪器设备电子分析天平（０．０００１ｇ）、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通ＰＣＲ仪、电泳系统、ｐＨ计、凝胶成像系统、４℃冰箱、超净工作台、－８０℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉、电子透射显微镜等。５．２　用具可调移液器（２．５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ、５０００μＬ）及相应的无ＲＮａｓｅ吸头、无ＲＮａｓｅ离心管、ＰＣＲ管、研钵、样品袋、标签等。５．３　试剂有特殊说明除外，所有实验用试剂均为分析纯。１犛犖／犜１１３５．３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.三抗体酶联免疫吸附测定试剂（见附录Ｂ）、ＲＴ  ＰＣＲ检测试剂（见附录Ｃ）。６　样品制备抽样按照ＳＮ／Ｔ２１２２的规定进行。将马铃薯块茎种植在隔离温室中，于２５℃生长并进行症状观察。待长出３片～４片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（１０株为１组）并编号。采集的叶片进行三抗体酶联免疫吸附测定、ＲＴ  ＰＣＲ、免疫电镜检测或生物学测定。７　检测方法７．１　三抗体酶联免疫吸附测定见附录Ｂ，其他有效的酶联免疫吸附测定检测方法可参照试剂说明书操作。７．２　犚犜  犘犆犚检测见附录Ｃ。７．３　免疫电镜检测按照ＳＮ／Ｔ１８４０中的方法进行电镜观察，参照附录Ａ病毒粒体形态判定免疫电镜检测结果。７．４　生物学测定见附录Ｄ。８　结果判定７．１、７．２、７．３和７．４中的两种检测结果为阳性，即可判定检出马铃薯帚顶病毒。９　样品保存与记录结果９．１　样品保存经检验确定携带马铃薯帚顶病毒的样品应在合适的条件下保存，马铃薯病薯块及叶片样品在－２０℃或－８０℃冰箱中保存，试管苗保存于组培室中，做好标记和登记工作。保存期满后，需经灭活处理。９．２　结果记录与资料保存完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。三抗体酶联免疫吸附测定检测应有酶联板反应的原始数据，ＲＴ  ＰＣＲ检测应有电泳图片，免疫电镜检测应有病毒粒体照片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。２犛犖／犜１１３５．３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）马铃薯帚顶病毒背景资料犃．１　寄主范围马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）是它唯一重要的自然寄主。在人工接种的情况下还可侵染茄科、藜科的２６种植物。犃．２　分布亚洲：日本、中国台湾、以色列。欧洲：爱尔兰、英国（苏格兰）、荷兰、芬兰、前捷克斯洛伐克、瑞典、丹麦和挪威。南美洲：玻利维亚、秘鲁、智利。犃．３　病害症状症状随季节的变化而不同，在马铃薯植株上一般表现为矮化（帚顶），叶片有褪绿和坏死的Ｖ型斑纹，薯块开裂，在较凉的环境下（１５℃）薯块上有贝壳状的坏死层。图犃．１　感染犘犕犜犞马铃薯植株犃．４　传播途径主要靠土壤中的马铃薯粉痂菌犛狆狅狀犵狅狊狆狅狉犪狊狌犫狋犲狉狉犪狀犲犪传播，汁液接种也能传毒。病薯块或组培苗可通过运输远距离传播。犃．５　粒体形态马铃薯帚顶病毒粒子为直杆状，长度为６５ｎｍ～８０ｎｍ、１５０ｎｍ～１６０ｎｍ和２９０ｎｍ～３１０ｎｍ，宽为１８ｎｍ～２０ｎｍ。３犛犖／犜１１３５．３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.图犃．２　犘犕犜犞病毒粒体犃．６　基因组特征该病毒的基因组为三组分，正义单链ＲＮＡ，分别为６．０ｋｂ，３．０ｋｂ～３．５ｋｂ和２．５ｋｂ～３．０ｋｂ。４犛犖／犜１１３５．３—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犅（规范性附录）三抗体酶联免疫吸附测定（犜犃犛  犈犔犐犛犃）犅．１　试剂犅．１．１　包被缓冲液（狆犎９．６）碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３）　　　　　　　　　　　　　　　１．５９ｇ碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ用蒸馏水溶解并定容至１Ｌ，４℃储存。犅．１．２　犘犅犛犜缓冲液（狆犎７．４）氯化钠（ＮａＣｌ）８．０ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）２．９ｇ氯化钾０．２ｇＴｗｅｅｎ  ２００．５ｍＬ用蒸馏水溶解并定容至１Ｌ。犅．１．３　样品抽提缓冲液亚硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ３）１．３ｇＰＶＰ（ＭＷ２４０００～４００００）２０．０ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ用ＰＢＳＴ缓冲液溶解并定容至１Ｌ，４℃储存。犅．１．４　单克隆抗体稀释缓冲液／酶标抗体稀释缓冲液小牛血清０．２ｇＰＢＳＴ１００ｍＬ犅．１．５　底物对硝基苯磷酸二钠（狆ＮＰＰ）犅．１．６　底物缓冲液二乙醇胺９７．