SN-T 1129-2015 牛病毒性腹泻-粘膜病检疫技术规范

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１２９—２０１５代替ＳＮ／Ｔ１１２９—２００７，ＳＮ／Ｔ１９０５—２００７牛病毒性腹泻／黏膜病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犫狅狏犻狀犲狏犻狉犪犾犱犻犪狉狉犺犲犪／犿狌犮狅狊犪犾犱犻狊犲犪狊犲２０１５０９０２发布２０１６０４０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准牛病毒性腹泻／黏膜病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１１２９—２０１５ 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲２号（１０００２９）北京市西城区三里河北街１６号（１０００４５）总编室：（０１０）６８５３３５３３网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本８８０×１２３０１／１６　印张１　字数２６千字２０１６年３月第一版　２０１６年３月第一次印刷印数１—１１００ 书号：１５５０６６·２  ２９８７３　定价１８．００元 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１１２９—２００７《牛病毒性腹泻／粘膜病检疫规范》和ＳＮ／Ｔ１９０５—２００７《牛病毒性腹泻／粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程》。本标准与所代替标准的主要技术差异如下： — — —整合了ＳＮ／Ｔ１１２９—２００７和ＳＮ／Ｔ１９０５—２００７内容； — — —按ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００８版）修改了试验方法。本标准修改采用了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｓａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ）（２００８版）中２．４．８。本标准与ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗手册》２．４．８相比，主要技术异同如下： — — —本标准采用了ＯＩＥ规定的病毒分离与鉴定、荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、微量血清中和试验及酶联免疫吸附试验方法； — — —本标准增加了ＯＩＥ中提及但没有详细操作规程的反转录聚合酶链式反应具体试验方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：白泉阳、孙颖杰、王伟利、王武军、孟庆峰、张体银、石建平、孟日增、张伯强、刘金华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： — — —ＳＮ／Ｔ１１２９．１ —２００２； — — —ＳＮ／Ｔ１１２９．２ —２００２； — — —ＳＮ／Ｔ１１２９—２００７； — — —ＳＮ／Ｔ１９０５—２００７。 Ⅰ犛犖／犜１１２９—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.牛病毒性腹泻／黏膜病检疫技术规范１　范围本标准规定了牛病毒性腹泻／黏膜病的临床诊断、病毒分离鉴定、荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、微量血清中和试验、抗原捕获酶联免疫吸附试验、反转录聚合酶链反应操作规程。本标准适用于进出口动物及其产品中牛病毒性腹泻／黏膜病的检疫。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１９４９５．２　转基因产品检测　实验室技术要求３　符号和缩略语ＢＶＤ：牛病毒性腹泻／黏膜病ＢＶＤＶ：牛病毒性腹泻／黏膜病病毒ＰＢＳ：磷酸缓冲盐溶液ＭＥＭ：最低基础培养基ＭＤＢＫ：牛肾传代细胞ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯ＴＣＩＤ５０：半数组织培养感染量ＲＮＡ：核糖核酸犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶ＲＴ  ＰＣＲ：反转录聚合酶链式反应４　临床诊断４．１　临床症状ＢＶＤ潜伏期为７ｄ～１４ｄ。急性病牛主要表现为突然发病，体温升高，重度腹泻，白细胞减少，大量流涎，口腔黏膜糜烂和溃疡，可在发病后几天死亡。慢性病例临床症状不明显或逐渐发病，生长发育受阻，消瘦，体重逐渐下降，比较特殊的症状是鼻镜上的糜烂，糜烂可在鼻镜上连成一片，表现为间歇性腹泻，病程较长，可在发病数周或数月后死亡。４．２　病理变化消化道黏膜充血、出血、水肿和糜烂。特征性病变是食道黏膜糜烂，呈大小和形态不一的直线排列。瘤胃黏膜出血、糜烂，第四胃炎性水肿、糜烂。小肠呈急性卡他性炎症，肠壁水肿增厚，大肠呈卡他性、出１犛犖／犜１１２９—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.血性、溃疡性以至坏死性炎症。在流产胎儿的口腔、食道、真胃及气管内可见出血斑和溃疡。５　病毒分离与鉴定５．１　主要仪器设备５．１．１　倒置显微镜。５．１．２　恒温培养箱。５．１．３　单道可调移液器。５．２　试剂和材料５．２．１　本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。５．２．２　１２．５ｃｍ２细胞培养瓶。５．２．３　无ＢＶＤＶ抗体胎牛血清。５．２．４　培养液：ＭＥＭ营养液、生长液、维持液，配制方法见附录Ａ中Ａ．１～Ａ．３。５．２．５　ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２，ＰＢＳ），配制方法见Ａ．４。５．２．６　细胞分散液：０．２５％胰蛋白酶，配制方法见Ａ．５。５．２．７　无ＢＶＤＶ感染的新生犊牛原代肾细胞或原代睾丸细胞，按常规胰酶消化方法制备。５．３　样品的采集５．３．１　对于牛群、种公牛的检疫，无菌采血液或精液。５．３．２　对怀疑为急性感染期或持续感染的牛，采取血液或鼻腔分泌物。５．３．３　对流产、死胎，采取胎儿组织。５．３．４　对怀疑死于黏膜病的牛，可采集血块和各组织，尤其是肠道集合淋巴组织。如果肠道样品已经发生自溶，可采集扁桃体或淋巴结。５．４　样品的处理５．４．１　血液按常规方法分离血清。５．４．２　精液冻融３次后，ＰＢＳ作１∶１０稀释，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液。５．４．３　动物组织加１０倍体积含有青霉素１０００ＩＵ／ｍＬ，链霉素１０００μｇ／ｍＬ的ＰＢＳ研磨，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液。５．５　样品的接种培养５．５．１　取生长良好，形成８０％以上单层的原代细胞培养瓶，弃去生长液，用ＰＢＳ洗涤１次，接种处理好的样品，每瓶接种１ｍＬ，每个样品接种３个细胞瓶，同时以ＰＢＳ作为阴性对照，置３７℃吸附１ｈ。５．５．２　弃去培养瓶内液体，加入维持液，置３７℃培养，逐日观察ＣＰＥ，待５０％以上细胞出现ＣＰＥ时收获培养物，如不出现ＣＰＥ，第６天收获培养物。５．５．３　将收获的培养物冻融３次，同一样品３瓶混合即为样品病毒分离培养物，冷冻保存，用于病毒鉴定。５．６　病毒鉴定病毒鉴定选择本标准中提供的竞争法荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验（ＩＰＭＡ）、抗原捕获酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）或反转录聚合酶链反应（ＲＴ  ＰＣＲ）方法进行鉴定。２犛犖／犜１１２９—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.６　竞争法荧光抗体试验６．１　主要仪器设备６．１．１　倒置荧光显微镜。６．１．２　二氧化碳培养箱。６．１．３　单道可调移液器、多道可调移液器。６．２　试剂和材料６．２．１　９６孔平底细胞培养板，带盖湿盒。６．２．２　病毒：ＢＶＤＶ标准毒株（ＯｒｅｇｏｎＣ２４Ｖ）。６．２．３　标准ＢＶＤＶ阳性血清：置－２０℃保存，工作浓度按说明书稀释。６．２．４　ＢＶＤＶ荧光抗体：置４℃保存，工作浓度按说明书稀释。６．２．５　无水乙醇，－２０℃预冷。６．２．６　其他试剂和材料见５．２．３～５．２．７。６．３　操作程序６．３．１　将生长良好的牛肾原代细胞，用细胞分散液处理后，以生长液配制成１．５×１０５个／ｍＬ的细胞悬液，加入９６孔细胞培养板内，