SN-T 1059.6-2016 出口食品中沙门氏菌属检测方法第6部分垂直膜过滤法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１０５９．６—２０１６代替ＳＮ／Ｔ１０５９．６ —２００８出口食品中沙门氏菌属检测方法第６部分：垂直膜过滤法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪犲犻狀犳狅狅犱犳狅狉犲狓狆狅狉狋—犘犪狉狋６：犞犲狉狋犻犮犪犾犿犲犿犫狉犪狀犲犳犻犾狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱２０１６０３０９发布２０１６１００１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ１０５９共分为７个部分： — — —ＳＮ／Ｔ１０５９．１　进出口食品中沙门氏菌　滤膜筛选法； — — —ＳＮ／Ｔ１０５９．２　进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数　滤膜／ＭＵＧ法； — — —ＳＮ／Ｔ１０５９．３　进出口食品平板菌落计数　滤膜法； — — —ＳＮ／Ｔ１０５９．４　进出口食品中大肠杆菌检验方法　谷氨酸脱羧酶法； — — —ＳＮ／Ｔ１０５９．５　食品和动物饲料大肠杆菌Ｏ１５７的检测方法　免疫磁珠法； — — —ＳＮ／Ｔ１０５９．６　出口食品中沙门氏菌属检测方法　第６部分：垂直膜过滤法； — — —ＳＮ／Ｔ１０５９．７　进出口食品中沙门氏菌检测方法　实时荧光ＰＣＲ法。本部分为ＳＮ／Ｔ１０５９的第６部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分代替ＳＮ／Ｔ１０５９．６ —２００８《进出口食品中沙门氏菌属检验方法　垂直膜过滤法》。本部分与ＳＮ／Ｔ１０５９．６ —２００８相比，主要技术变化如下： — — —修改了标准的中英文名称； — — —修改了标准的范围（见第１章，２００８年版第１章）； — — —修改了规范性引用文件（见第２章，２００８年版第２章）； — — —修改了样品制备和增菌培养（见７．１）； — — —修改了培养基（见附录Ａ，２００８年版附录Ａ）。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吴斌、刘淑艳、蔡晓萍、于畅、张雪。本部分所代替标准的历次版本发布情况为： — — —ＳＮ／Ｔ１０５９．６ —２００８。 Ⅰ犛犖／犜１０５９．６—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.出口食品中沙门氏菌属检测方法第６部分：垂直膜过滤法１　范围ＳＮ／Ｔ１０５９的本部分规定了出口食品中沙门氏菌属 垂直膜过滤检验方法。本部分适用于出口食品中沙门氏菌属的检验。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ４７８９．４　食品安全国家标准　食品微生物学检验　沙门氏菌检验３　原理本方法是基于垂直过滤的方式使测试样品通过包被有特别沙门氏菌抗体的膜，样品中的沙门氏菌抗原与膜上抗体结合，通过酶偶合物将抗原抗体结合物显色。若是阳性样品，试剂中央出现蓝色的圆点，反之为无色的圆点。４　设备与材料４．１　滤器：备有预滤器。４．２　真空泵。４．３　滤膜：有机相或水相，孔径０．４５μｍ。４．４　培养箱：３６℃±１℃ ，４２℃±１℃ 。４．５　水浴箱：４５℃±１℃ ，３６℃±１℃ 。４．６　吸管：１ｍＬ、１０ｍＬ，具刻度。４．７　锥形瓶：容量２５０ｍＬ、５００ｍＬ。４．８　试管：１７ｍｍ×１７０ｍｍ。４．９　玻璃珠：５ｍｍ。４．１０　平皿：直径９０ｍｍ。４．１１　天平：感量０．１ｇ。４．１２　均质器。５　培养基和试剂５．１　缓冲蛋白胨增菌液（ＢＰＷ）：见附录Ａ中Ａ．１。５．２　ＲＶＳ肉汤：见Ａ．２。５．３　ＭＫＴＴｎ肉汤：见Ａ．３。１犛犖／犜１０５９．６—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．４　木糖赖氨酸脱氧胆盐（ＸＬＤ）琼脂：见Ａ．４。５．５　亚硫酸铋（ＢＳ）琼脂：见Ａ．５。５．６　ＨＥ琼脂：见Ａ．６。５．７　四乙酸二氨基乙烷（ＥＤＴＡ）：０．２ｍｏｌ／Ｌ。５．８　沙门氏菌检测膜。５．９　检测膜配套溶液：见Ａ．７。６　检验程序检验程序见图１。图１　沙门氏菌属垂直过滤法检验程序７　操作步骤７．１　样品制备和增菌培养７．１．１　如为冷冻样品，应在４５℃以下不超过１５ｍｉｎ，或在２℃～５℃不超过１８ｈ解冻。若不能及时检验，应置于－１５℃左右保存。非冷冻而易腐的食品，置于４℃冰箱保存。７．１．２　称取２５ｇ（ｍＬ）样品放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ的灭菌均质杯中，以８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或置于盛有２２５ｍＬＢＰＷ的灭菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。无菌操作将样品转至５００ｍＬ无菌锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于３６℃水浴培养１８ｈ±２ｈ，进行前增菌。７．１．３　轻轻摇动培养过的样品混合物，移取０．１ｍＬ，转种于盛有１０ｍＬＲＶＳ肉汤的无菌试管中，混合均匀，于４１．５℃±１℃ 培养２４ｈ±３ｈ；或移取１ｍＬ，转种于１０ｍＬＭＫＴＴｎ肉汤的无菌试管中，混合均匀，于３６℃±１℃ 培养２４ｈ±３ｈ，进行选择性增菌。２犛犖／犜１０５９．６—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.７．２　分离用接种环取选择性增菌液１环，划线接种于一个ＢＳ琼脂平板和一个ＸＬＤ琼脂平板（或ＨＥ琼脂平板），于３６℃±１℃ 分别培养１８ｈ～２４ｈ（ＸＬＤ琼脂平板、ＨＥ琼脂平板）或培养４０ｈ～４８ｈ（ＢＳ琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。沙门氏菌典型菌落特征为：ＢＳ琼脂上，菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。ＨＥ琼脂上，菌落为蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。ＸＬＤ琼脂上，菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落，有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。７．３　鉴定７．３．１　吸取２５０μＬＰＢＳ缓冲液至玻璃试管中。７．３．２　从选择性平板上挑取５个典型菌落，移至试管中，混合均匀制成样品液，室温培养（２５ ℃）１０ｍｉｎ。７．３．３　加入８００μＬ０．５％吐温２０磷酸盐缓冲液于样品液中，并均匀混合。７．３．４　加入２００μＬ样品液至膜上。７．３．５　加入２５０μＬ０．２ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液。７．３．６　加入２５０μＬＴＭＢ底物溶液。７．３．７　加入１００μＬ２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液，终止反应。７．３．８　着色后稳定几秒后判读结果：应在５ｍｉｎ内读取结果，否则无效。７．３．９　检测过程中同时设置阴、阳性对照，以沙门氏菌纯培养物为阳性对照，实验用水为阴性对照。８　结果判定８．１　质控阴性对照结果应为无色。阳性对照结果应为蓝色。８．２　结果判定在符合８．１的情况下，被检样品进行检测时，如检测膜呈现均匀的蓝色，没有斑点，可以看到整个测试区域表面，判为沙门氏菌属筛选阳性。否则，判为沙门氏菌属筛选阴性。筛选阴性的被检样品报告未检出，筛选阳性的被检样品，按照ＧＢ４７８９．４进行确证，报告以该检测结果为准。３犛犖／犜１０５９．６—２０１６ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（规范性附录）培养基犃．１　缓冲蛋白胨增菌液蛋白胨　　　　　　　　　　１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ磷酸氢二钠（含１２Ｈ２Ｏ）９．０ｇ磷酸二氢钾１．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ将各成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，静置约１０ｍｉｎ，加热煮沸至完全溶解，调至ｐＨ７．２±０．１，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，临用时，以无菌操作分装灭菌玻璃瓶，每瓶２２５ｍＬ。犃．２　犚犞犛肉汤大豆蛋白胨４．５ｇ氯化钠７．２ｇ磷酸二氢钾１．３ｇ磷酸氢二钾０．２ｇ无水氯化镁２８．６ｇ孔雀石氯３６．０ｍｇ蒸馏水１０００ｍＬ将各成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，静置约１０ｍｉｎ，加热煮沸至完全溶解，调至ｐＨ７

SN-T 1059.6-2016 出口食品中沙门氏菌属检测方法 第6部分 垂直膜过滤法

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