ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 575—2019 代替NY/T575—2002 牛传染性鼻气管炎诊断技术 Diagnostic techniques for infectious bovine rhinotracheitis 2019-08-01 发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T575—2019 前言 全国农业食品标准 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 公共服务平台 修改外主要技术变化如下： -增加了引言（见引言）； 修改了范围（见第1章）； -增加了规范性引用文件（见第2章）； 增加了缩略语（见第3章）； 修改了病毒鉴定中和指数的判定标准（见4.4)； -增加了实时荧光PCR试验（见第7章）； 一增加了细胞培养液的配制和实时荧光PCR试验过程防止交叉污染的措施（见附录A和附录C)。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、华中农业大学 本标准主要起草人：李晓成、郭爱珍、张志、李庆妮、吴发兴、张芳、胡长敏、刘爽、陈颖钰、董雅琴、陈曦、 张慧、姜传文、侯桂先、刘瑞宁、陈焕春。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： NY/T575—2002。 NY/T575—2019 牛传染性鼻气管炎（Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR）是家养牛和野牛的一种病毒性传染病，病 原是牛传染性鼻气管炎病毒（Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV），学名为牛疱疹病毒I型（Bo- vineherpesvirus1,BoHV-1)。该病广泛分布于世界各地。世界动物卫生组织（OIE)将其列为牛的法定 报告疫病，我国将其列为二类动物疫病。该病死亡率较低，许多感染牛呈亚临床症状经过，往往由于细菌 继发感染导致更为严重的呼吸道疾病。 本标准参考世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2017年OIE官方网站在线 PCR诊断方法并引人到本标准中 TURAL ICU G 人 IⅡ NY/T 575-2019 牛传染性鼻气管炎诊断技术 1范围 本标准规定了牛传染性鼻气管炎的诊断技术要求。 本标准规定的病毒分离鉴定适用于牛疱疹病毒1型的分离鉴定；微量血清中和试验和酶联免疫吸 试验适用于牛群牛传染性鼻气管炎的流行病学调查、监测和诊断；实时荧光PCR试验适用于快速检测牛 疱疹病毒I型感染。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BoHV-1:牛疱疹病毒 I型(bovine herpesvirus type 1) CPE:细胞病变(cytopathic effect) Ct值：循环阈值（cyclethreshold) IBR：牛传染性鼻气管炎（infectious bovinerhinotracheitis） MDBK:牛肾细胞系(madin-darby bovine kidney cell line) TCIDso：组织培养半数感染量(50%tissuecultureinfectivedoses) 4病毒分离鉴定 4.1材料 4.1.1试剂 4.1.1.1青霉素-链霉素溶液（青霉素10000U/mL，链霉素10000μg/mL）。 4.1.1.2无BoHV-1抗体新生牛血清。 4.1.1.3DMEM培养液、细胞生长液和细胞维持液（配制方法见附录A）。 4.1.1.40.25%EDTA胰酶。 4. 1. 1.5BoHV-1标准阳性血清和 BoHV-1标准阴性血清。 4.1.1.6MDBK细胞或睾丸原代或睾丸次代细胞。 4.1.2器材 4.1.2.1组织匀浆机。 4.1.2.2离心机。 4.1.2.3恒温二氧化碳培养箱。 4.1.2.4倒置显微镜。 4.1.2.5无菌棉拭子。 4.1.2.60.22μm孔径滤器。 4.1.2.7微量可调移液器。 1 NY/T 575—2019 4.1.2.8无菌移液器吸头。 4.1.2.9细胞瓶（T25cm²）。 4.1.2.10无菌96孔细胞培养板。 4.2样品 4.2.1样品采集 4.2.1.1拭子样品 用无菌棉拭子反复刮擦，采取鼻道、生殖道和眼分泌物，立即将拭子浸入1.0mLDMEM培养液（含 青霉素1000U/mL、链霉素1000μg/mL、2%~5%的无BoHV-1抗体新生牛血清、pH7.2)中。 4.2.1.2组织样品 剖检时，无菌采集牛呼吸道黏膜、扁桃体、肺、脑中三叉神经节。对刚死亡的胎儿，无菌采集肺、肾、脾 等各种组织样品。 4.2.1.3精液 采集0.5mL新鲜精液或冷冻精液。 4.2.2样品运送 采集的样品立即4℃储存,24 h内送 并按NY/T54I的规定执 4.2.3样品处理 TA 4.2.3.1拭子样品 S 2次# 振荡2 min.拧干拭子样品液经10000min离心 取上清液，经 将拭子样品冻融 0.22μm孔径滤器过滤，滤液作为 接种分离材料。 4.2.3.2组织样品 用无菌剪镊取适量组织先用DMEM培养液制成20%的匀浆液，再经10000 10 min,取 4.2.3.3精液 精液通 有毒性，可 min. ENT 抑制病毒增殖，接种前应预先用DMEM培养液作15稀释。 4.3操作方法 R 4.3.1接种培养 瓶(T25 cm²)中。 4.3.1.2每个样品接种4瓶，置37℃吸附1h后，倾去接种液，用DMEM培养液洗3次，最后加人细胞维 持液5mL。 4.3.1.3置37℃培养，逐日观察CPE，若7d仍不出现CPE，则收获培养物继代于新制备的细胞单层上， 盲传三代后，观察CPE，出现CPE者收获培养物，保存丁 待鉴定 4.3.1.4BoHV-1在MDBK细胞和睾丸原代或次代细胞上形成CPE的特征：细胞变圆，聚合，呈葡萄串 状或拉网状，最后脱落。 4.3.2测定中和指数 4.3.2.1取出现CPE的细胞培养物，经冻融2次后，以10000r/min离心10min。 4.3.2.2取上清液，用DMEM培养液作10倍递增稀释至10-7。 4.3.2.3分别将BoHV-1标准阳性血清（中和效价1：32或以上)和BoHV-1标准阴性血清与每个稀释 度病毒液等量混合，置37℃中和1h。 4.3.2.4将病毒血清混合物接种96孔细胞培养板，每个样品接种4孔，每孔100μL。 4.3.2.5每孔加入MDBK细胞悬液（每毫升含30万～40万细胞)100μL。置37℃培养，观察72h~120h， 2 NY/T 575—-2019 每天记录CPE和无CPE的孔数。 4.3.2.6按Reed-Muench方法计算TCIDo。计算公式见式(1)、式(2)。 TCIDso =lgD+L X Igd (1) 式中： D一一高于50%百分数的病毒稀释度； L ——距离比值; d —稀释系数。 L=(P1-50)/(P,-P2). (2) 式中： P1——高于50%的百分数； P2——低于50%的百分数。 4.3.2.7计算中和指数 中和指数是标准阴性血清处理后的病毒毒价(lg10)和标准阳性血清处理后的病毒毒价(lg10)之差。 4.4结果判定 分离物引起典型BoHV-1细胞病变且中和指数>1.5时，即可确定分离物为BoHV-1。 5微量血清中和试验 5.1材料 5.1.1试剂 5.1.1.1BoHV-1标准毒株(IBR Baitha-Nu/67弱毒株)冻干毒 5.1. 1.2 BoHV-1标准阳性血清和 BoHV-1标准阴性血清。 5.1.1.3无BoHV-1抗体新生牛血清。 5.1.1.4DMEM培养液、细胞生长液和细胞维持液（配制方法见附录A）。 5. 1.1.5 MDBK 细胞 5.1.1.6 0.25% EDTA胰酶。 5.1.2器材 5.1.2.1水浴锅。 5.1.2.2恒温箱。 5.1.2.3微量可调移液器。 5.1.2.4无菌移液器吸头。 5.1.2.5无菌96孔细胞培养板。 5.1.2.6恒温二氧化碳培养箱。 5.1.2.7倒置显微镜。 5.1.3病毒抗原制备 5.1.3.1用细胞生长液培养MDBK细胞，待细胞长成良好单层后，用DMEM培养液洗2次。 5.1.3.2将IBRBaitha-Nu/67弱毒株冻干毒用DMEM培养液作10倍递增稀释。 5.1.3.3按原培养液1/10量接毒，置37℃吸附1h，然后加入细胞维持液至原培养液量，置37℃培养。 5.1.3.4待80%～90%细胞出现BoHV-1感染典型CPE时收获培养物，冻融2次后，以10000r/min 离心10min，其上清液即为病毒抗原。 5.1.3.5测定病毒毒价（TCIDso），分装小瓶，每瓶1mL，做好标记和收毒日期，储存于一70℃备用。半 年内病毒毒价保持不变。 5.1.4病毒毒价(TCIDso)测定 3 NY/T 575—2019 5.1.4.1将制备的病毒抗原，用DMEM培养液作10倍递增稀释至10-7。 5.1.4.2每一个稀释度接种96孔细胞培养板的4个孔，每孔50μL。 5.1.4.3每孔加人细胞悬液（每毫升含30万～40万细胞)100μL和细胞维持液50μL。同时，设4孔细 胞为正常对照。置37℃培养，观察