ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 567—2017 代替NY/T567—2002 兔出血性败血症诊断技术 Diagnostic techniques for rabbit haemorrhagic septicemia 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 567—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T567—2002《兔出血性败血症诊断技术》。与NY/T567—2002相比，除编辑性 修改外,主要技术变化如下： 增加了兔出血性败血症的临床诊断和病理变化; 增加了多杀性巴氏杆菌PCR检测方法； 增加了多杀性巴氏杆菌荚膜型多重PCR检测方法； 删除了多杀性巴氏杆菌荚膜分型的血清学方法； -增加了多杀性巴氏杆菌kmtl基因引物序列和PCR扩增靶序列； 增加了多杀性巴氏杆菌荚膜型多重PCR引物序列。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAT/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、江苏省农业科学院兽医研究所、山东农业科 学院家禽研究所。 本标准主要起草人：曲连东、郭东春、王芳、刘家森、刘春国、范志宇、黄兵。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -NY/T 567—2002。 I NY/T 567—2017 免出血性败血症诊断技术 1范围 本标准规定了兔出血性败血症(兔巴氏杆菌病)临床诊断和实验室诊断技术要求。 本标准适用于兔出血性败血症流行病学调查、诊断、检疫以及病原的荚膜分型。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR 指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步 骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 4临床诊断 4.1流行特点 各个品种、不同年龄的家兔均易感,其中以9周龄至6月龄的兔最易感。潜伏期一般为数小时到几 天。病兔和带菌兔是此病流行的主要传染源。病原菌随病兔的唾液、鼻腔分泌物、粪便以及尿液等排 出，污染饲料、饮水、用具和环境，经呼吸道、消化道、皮肤和黏膜伤口感染。本病一年四季均可发生，以 春、秋两季多发,呈散发或地方性流行。 4.2临床症状 4. 2.1 败血症型 4.2.1.1最急性的病例无明显临床症状而突然死亡。 4.2.1.2急性的病例表现为精神委顿，食欲废绝，呼吸急促，体温40℃以上，鼻腔有分泌物，有时出现 腹泻，常在1d～3d死亡。临死前体温下降,四肢抽搐。 4.2.1.3慢性的病例表现为呼吸困难、急促，鼻腔流出黏脓性分泌物，常打喷嚏。体温稍高，食欲减退， 有时还出现腹泻,关节肿胀,结膜炎。病程1周～2周或更长,最终衰竭死亡。 4.2.2鼻炎型 4.2.2.1发病初期,鼻黏膜发炎,鼻腔先流出浆液性分泌物，以后转为黏液性以至黏脓性分泌物，常打 喷嚏、咳嗽。 4.2.2.2发病中期，前爪擦揉鼻端，鼻端附近的被毛潮湿、脱落。上唇和鼻孔皮肤红肿、发炎。 4.2.2.3发病后期,鼻腔分泌物黏稠,鼻端周围形成痴壳,堵塞鼻孔,呼吸困难，出现呼噜音。 4.2.3肺炎型 4.2.3.1多见于成年兔，病初食欲不振、精神沉郁、体温较高，有时还出现腹泻、关节肿胀等。 4.2.3.2出现明显的呼吸困难时，呈急性经过，急性死亡。 1 NY/T 567—2017 4.2.4中耳炎型 4.2.4.1典型症状是斜颈，向一侧滚转，一直斜倾到围栏侧壁为止，并反复发作。 4.2.4.2可出现运动失调和其他神经症状。 4.2.4.3严重时，采食、饮水困难，逐渐消瘦，衰竭死亡。 4.2.5结膜炎型 多发生于青年兔和成年兔。初期时,结膜潮红、眼脸肿胀，多为两侧性，有浆液性、黏液性或黏脓性 分泌物；中后期时,红肿消退，但流泪不止。 4.2.6生殖系统感染型 多见于成年兔。母兔表现为不孕，伴有黏脓性分泌物从阴道流出，如转为败血症，往往造成死亡；公 兔表现为一侧或两侧睾丸肿大 4.2.7脓肿型 官脓肿往往不表现临床症状。 4.3病理变化 4.3.1 败血症型 4.3.1.2鼻腔黏膜 充血有 黏液脓性分泌物 4.3.1.3喉头 黏膜充血、出 出血，气管黏膜充血、出血，伴有少量泡沫 4.3.1.4 肺脏充血 、水肿。 4.3.1.5 心内、 、外膜出血 4.3.1. 6 肝脏变 变性，有弥漫性坏死点。 4.3. 1.7 脾脏、 淋结肿大、出血 CEN 4.3.1.8 小肠黏膜充血、出血。 4.3.1.9胸腔 复腔有积液 4.3.2鼻炎型 C 时发生糜烂。黏膜表面附有浆液性、黏 液性或 性分泌物。 4.3.2.2鼻窦或 副鼻 4.3.3肺炎型 4. 3.3.1 病变部位主要位于肺尖叶、 、心叶和隔叶前下部,表现为肺充血、出血 实变、膨胀不全、肿和 出现灰白色小结节。 4.3.3.2肺胸膜与心包膜常有纤维素附着,胸腔积液 4.3.3.3肺门淋巴结充血、肿大 4.3.3.4鼻腔和气管黏膜充血、出血,有黏性分泌物 4.3.4中耳炎型 4.3.4.1病兔一侧或两侧鼓室内有白色渗出物。 4.3.4.2鼓膜破裂时，外耳道内可出现白色渗出物。 4.3.4.3炎症蔓延到脑部,可出现化脓性脑膜炎。 4.3.5结膜炎型 多为两侧性，眼脸中度肿胀,结膜发红，分泌物常将上下眼脸粘封。 4.3.6生殖系统感染型 母兔多出现子宫炎或子宫积脓；公兔多出现睾丸炎和附睾炎。 2 NY/T 567—2017 4.3.7脓肿型 皮肤、内脏器官出现脓肿。 4.4结果判定 免出现4.2临床症状和4.3病理变化,结合4.1流行特点,可判定为疑似兔出血性败血症。 5 实验室诊断 5.1器材 恒温培养箱、恒温水浴锅、Ⅱ级生物安全柜、光学显微镜、台式离心机、PCR扩增仪、电泳系统、凝胶 成像仪或紫外分析仪。 5.2样品采集 对疑似败血症型病兔,无菌采集心血、肝脏、脾脏或体腔渗出物等；对于其他类型的病兔，无菌采集 病变部位的脓汁、渗出物、分泌物等。 5.3病原分离鉴定 5.3.1培养基及试剂 5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂培养基、鲜血琼脂培养基和5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基的配制见 附录A。革兰染色液和/或瑞氏染色液、市售细菌生化鉴定试剂、市售0.01mol/LPBS(pH7.4)。 5.3.2分离培养 将采集样品无菌划线接种于麦康凯琼脂培养基、5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂培养基、鲜血琼脂培养 基或5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基上,在35℃～37℃下培养,经18h～24 h培养后观察菌落形态。 进行纯培养。 5.3.3培养特性观察 多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂培养基上不生长,鲜血琼脂培养基上不产生溶血。5%鸡血清葡萄糖 淀粉琼脂培养基和5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基上菌落散在、圆形、表面凸起的小菌落,直径为 1 mm~3 mm。 5.3.4细菌染色 从符合5.3.3培养特性的菌落上挑取少量细菌涂片，采用甲醇固定或火焰固定。甲醇固定的镜检 样品进行瑞氏染色，火焰固定的镜检样品进行革兰染色。 5.3.5镜检观察 瑞氏染色镜检时，多杀性巴氏杆菌呈两极浓染的菌体，常有荚膜。革兰染色镜检时，多杀性巴氏杆 5.3.6生化鉴定结果 将符合5.3.5镜检结果的菌落进行纯培养,取纯培养物进行生化鉴定。多杀性巴氏杆菌具有下列 生化特征： a）分解葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖和甘露醇产酸而不产气,不分解鼠李糖、戊醛糖、纤维二糖、棉 子糖、菊糖、赤藓糖、戊五醇、M-肌醇、水杨苷； b) 靛基质阳性，VP试验阴性； c）产生过氧化氢酶、氧化酶; d）不产生尿素酶、β-半乳糖苷酶。 5.3.7动物接种试验结果 对纯培养细菌用无菌PBS洗涤后进行细菌计数，按照每0.2mL1X103CFU剂量腹腔接种6周 龄～8周龄BalB/C小鼠5只,逐日观察。 多杀性巴氏杆菌接种小鼠7d内全部死亡,并可从小鼠体内分离到多杀性巴氏杆菌。 3 NY/T 567—2017 5.3.8结果判定 分离的细菌符合培养特性、镜检结果、生化鉴定结果和动物接种试验结果，可判为病原分离鉴定 阳性。 5.4多杀性巴氏杆菌PCR检测方法 5.4.1试剂与材料 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB/T6682的要求。 市售商品化细菌基因组 DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、10X PCR Buffer、dNTP、DL 2000 DNA Marker、电泳缓冲液(TAE)(见A.4)1.5%琼脂糖凝胶(见 A.5）。 5.4.2样品处理 将分离培养的疑似菌和纯培养的菌落保存于 30% +油PBS中的无菌1.5mL塑料离心管中， 密封、编号、保存、送检。 5.4.3DNA的提取 ARD 4.2中 的细菌基因组「 日性对照为多杀性巴氏杆菌 G C51～C17 株制备的模板 DNA,阴性对照为无菌的去离子水, 5. 4. 4. 1 所用引物 PCR引物根据 巴氏杆菌kmtl 基因序列设计,具体参见附录 B 5.4.4.2反应体系 每个样品20 uL反应体系，组成如下 中 10XPCR缓 2.0μL dNTPs(2. mml/ L 上游引物（10 μhol/μL) 下游引物（10 模板DNA(样 品） Taq DNA 去离子水 R 5