ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 566—2019 代替NY/T566—2002 猪丹毒诊断技术 Diagnostic techniques for swine erysipelas 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T566—2019 前言 出服务 本标准代替NY/T566—2002《猪丹毒诊断技术》。与)NYT/5662002相比，除编辑性修改外主要 技术变化如下： 行了修订（见3.1)； -增加了病理变化（见3.2）； 生化试验按照Bergey'sManualofSystematicBacteriology（2ndEdition）进行了修订（见4.2.3）； 一“4.2病原鉴定”增加了猪丹毒杆菌的鉴别PCR方法（见4.2.4)； 一附录A中培养基按照《中国兽药典》（2015年版，三部进行了修订。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国兽医药品监察所。 本标准起草人：李伟杰、蒋桃珍、魏财文、岂晓鑫、田野、蒋颖、王团结、彭国瑞。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -NY/T566—2002。 NY/T 566—2019 引言 猪丹毒（swineerysipelas）是由红斑丹毒丝菌（Erysipelothrixrhusipathiae），也称为猪丹毒杆菌或猪 丹毒丝菌，引起的一种急性、热性传染病。 该病呈世界性分布，包括我国许多地区，我国通过疫苗普遍接种，该病得以全面控制，但近年来又在多 地重现。该病主要通过消化道传播，还可借助吸血昆虫、鼠类和鸟类传播。主要侵害架子猪（3月龄～6月 龄），临床表现主要为急性败血型、亚急性的疹块型和慢性心内膜炎型，病死率可达80%。世界动物卫生 组织尚未将该病列人动物疫病名录，且未推荐诊断技术。我国定为三类动物疫病。 人也可感染猪丹毒杆菌，称为“类丹毒”。人的病例多由损伤皮肤感染， 般经2周～3周自愈。类丹 毒是一种职业病，多发生于兽医、屠宰人员以及渔业工作者B包今未见人因感染猪丹毒杆菌而死亡的报告。 猪丹毒杆菌的型特异性抗原，对热稳定,是血清学分型的基础这些抗原由细胞壁的肽聚糖组成，采 6、8、9、11、12、15、 16、17、19、21和N），临床分离的猪丹毒杆菌主要 NY/T566—2019 猪丹毒诊断技术 1范围 本标准规定了猪丹毒诊断的技术要求。 本标准所规定的临床诊断和病原鉴定，适用于猪丹毒的诊断；试管凝集试验适用于流行病学调查和 SPF猪群的监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T541兽医诊断样品采集、保存和运输技术规范 3临床诊断 3. 1临床症状 3.1.1 急性型 3.1.1.1急性经过，突然死亡。 3.1.1.2病猪体温升高达42℃以上，呈稽留热。精神沉郁，喜卧，不愿走动，厌食，有的呕吐。感染后 2d～3d在猪的耳后、颈部、胸腹部等部位出现各种形状的暗红色或暗紫色丘疹，用手指按压褪色。 3.1.2亚急性型 病猪食欲减退，体温升高至41℃以上,精神不振,不愿走动。发病1 d～3d后在胸、腹、背、肩、四肢外 侧等部位的皮肤出现方形、菱形或圆形的紫红色疹块，稍突起于皮肤表面，用手指按压褪色 3.1.3慢性型 3.1.3.1浆液性纤维素性关节炎：四肢关节肿胀、变形，肢体僵硬，出现跛行，严重者卧地不起。 3.1.3.2心内膜炎：精神萎靡，消瘦，不愿走动，呼吸急促。听诊心脏有杂音，心律不齐。 3.1.3.3皮肤坏死：背、肩、耳、蹄和尾等部位皮肤坏死，可能出现皮肤坏疽、结痴。 3.2病理变化 3.2.1急性型 肾脏肿大，呈花斑状，外观呈暗红色，皮质出血，切面外翻，肾包膜易剥离。脾脏肿大充血，呈樱桃红 色，切面外翻，用刀背轻刮有血粥样物，脾切面的白髓周围有“红晕”现象。淋巴结肿大，紫红色，切面有斑 点状出血。 3.2.2亚急性型 疹块内血管扩张，皮肤和皮下结缔组织水肿。 3.2.3慢性型 3.2.3.1心内膜炎：心内膜上有灰白色菜花样血栓性增生物，主要发生在二尖瓣，其次是主动脉瓣、三尖 瓣和肺动脉瓣上。 3.2.3.2多发性增生性关节炎：四肢关节肿胀、变形,有大量浆液性纤维素性渗出液。 4实验室诊断 4.1病原分离 1 NY/T566—2019 4. 1. 1 仪器与耗材 4. 1. 1. 1 Ⅱ级生物安全柜。 4. 1. 1. 2 恒温培养箱（37℃）。 4. 1. 1. 3 高压灭菌锅。 4. 1.1.4 手术刀。 4. 1. 1.5 镊子。 4. 1. 1. 6 接种环。 4. 1. 1.7 平皿（直径60mm~90mm）。 4.1.2培养基与试剂 4.1.2.1马丁琼脂（配制见附录A中的A.1,也可用商品化培养基 4.1.2.2健康新生牛血清。 4.1.3采集病料。 PUBL 按照NY/T541进行样品采集保存占运输。 急性病例可采集耳静脉血，死后取心血、肝、脾、淋巴结 4.1.4分离培养 Q 将病料划线接种于含10%新生生血清 丁琼脂平血，37℃培养 36h 48 h姚 飞取单菌落传代接种含 10%健康新生牛血清马丁琼脂平血.37℃培养2463 36h.获得纯增养 4.2病原鉴定 S 4.2.1培养特性及菌体形态 4.2.1.1仪器与耗材 A 4.2.1.1.1Ⅱ级生物安全柜 4.2. 1. 1.2 恒温培养箱（37℃ 4.2.1.1.3显微镜 4.2.1.1.4高压灭菌金 4.2.1.1.5接种环 4.2.1.1.6载玻片 4.2.1.2培养基与试剂 R 4.2.1.2.1马丁琼脂（配制见A. ，也可用商品化培养基 4.2.1.2.2新生牛血清 4.2.1.2.3革兰染色试剂盒 4.2.1.3操作 取分离菌株纯培养物划线接种于含10%新生牛血清马丁琼脂，37℃培养24h～36h，肉眼观察；取菌 落制备涂片，革兰氏染色镜检。 4.2.1.4结果判定 在含10%新生牛血清马丁琼脂平血上形成表面光滑、边缘整齐、有蓝绿色荧光的小菌落，革兰氏染色 镜检为阳性细杆菌，符合以上特征判为可疑菌落。 4.2.2动物试验 4.2.2.1仪器与耗材 4.2.2.1.1Ⅱ级生物安全柜。 4.2. 2. 1. 2 恒温培养箱（37℃）。 4.2. 2. 1. 3 高压灭菌锅。 4.2.2.1.4 一次性注射器（1mL）。 2 NY/T 566-2019 4.2.2.2培养基与试剂 4.2.2.2.1马丁肉汤（配制见A.2，也可用商品化培养基）。 4.2.2.2.2生理盐水。 4.2.2.3试验动物 4.2.2.3.1 小鼠(18 g~22 g,SPF级)。 4.2.2.3.2鸽子（30日龄～60日龄）。 4.2.2.3.3豚鼠（350g~450g，清洁级） 4.2.2.4操作 取分离菌株纯培养物接种马丁肉汤，37℃培养24h，菌液用生理盐水进行5倍～10倍稀释，取稀释的菌 液分别注射小鼠3只（皮下0.2mL）、鸽子2只（肌肉1.0mL）和豚鼠2只（肌肉1.0ml），连续观察5d。 4.2.2.5结果判定 小鼠和鸽子应全部死亡，豚鼠应全部健康成活。 4.2.3生化试验 4.2.3.1仪器与耗材 4.2.3.1.1ⅡI级生物安全柜。 4.2.3.1.2 2恒温培养箱（37℃）。 4.2.3.1.3高压灭菌锅。 4.2.3.1.4接种环。 4.2.3.2培养基与试剂 4.2.3.2.1马丁琼脂（配制见A.1，也可用商品化培养基）。 4.2.3.2.2新生牛血清。 4.2.3.2.3生化试验小管。 4.2.3.3操作 取分离菌株纯培养物划线接种含10%新生牛血清马丁琼脂，37℃培养24h～36h，挑取菌落接种生 化试验小管进行培养。 4.2.3.4结果判定 猪丹毒杆菌生化试验结果应符合表1的规定。 表1猪丹毒杆菌生化试验 生化试验 结果 β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase) 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase） 一 N-乙酰-β-葡萄糖胺酶（N-Acetyl-β-glucosamidase) +(v) β甘露糖苷酶（β-Mannosidase） 一 L-阿拉伯糖(L-Arabinose) + N-乙酰-D-甘露糖胺(N-Acetyl-D-mannosamine) + 熊果苷（Arbutin） 一 纤维二糖(Cellobiose) 一 D-果糖(D-Fructose) + D-半乳糖(D-Galactose) + 龙胆二糖(Gentiobiose) 3 NY/T566—2019 表1(续) 生化试验 结果 丙三醇（Glycerol) α-D-乳糖(α-D-Lactose) +(v) D-甘露糖（D-Mannose） +(v) 3-甲基葡萄糖（(3-Methylglucose) 一(v) D-阿洛酮糖(D-Psicose) + D-核糖(D-Ribose) (v) 水杨苷（Sallicir PUBL D-海藻糖(D-1 Trehalos 注：十为阳性；一为阴性;v 为可变》 4.2.4PCR鉴定 S 4.2.4.1仪器与耗材 4.2. 4.1.2 冰箱 4.2.4.1.3 台式高速离心机 4. 2. 4. 1. 4 PCR 仪 4. 2. 4. 1.5 电泳仪 4. 2. 4. 1. 6 4. 2. 4. 1. 7 微量可调 或 00 或200 4.2. 4.1.8 高