ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 560—2018 代替NY/T 560—2002 小鹅瘟诊断技术 Diagnostic techniques for gosling plague 2018-05-07 发布 2018-09-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 560—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T 560—2002《小鹅瘟诊断技术》。与NY/T 560—2002相比,除编辑性修改外主 要技术变化如下： “范围”部分增述了免疫荧光(IFA)试验和多聚酶链式反应(PCR)检测方法的适用性; （,,,， “间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA)"修改为“夹心酶联免疫吸附试验（夹心ELISA)”（见 3.2.2); -增加了小鹅瘟病毒抗原和抗体间接免疫荧光方法（见3.2.3；4.3）； 增加了小鹅瘟病毒PCR检测方法(见3.2.4)。 本标准由农业农村部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAT/TC181)归口。 本标准起草单位：扬州大学、中国动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：秦爱建、钱琨、叶建强、蒋菲、邵红霞、刘洋。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -NY/T 560—2002。 I NY/T 560—2018 引言 小鹅瘟又称鹅细小病毒(Goose parvovirus)病,或称德兹西氏病(Derzsy's disease),是维鹅的一种 急性败血性传染病。世界所有养鹅的国家均有此病的发生。本病主要侵害1月龄以内雏鹅和维番鸭， 多呈最急性和急性感染而迅速致死。1月龄以上的小鹅发病减少,呈慢性过程。本病一且发生、流行， 常引起大批维鹅死亡，造成重大经济损失 本病病原为小鹅瘟病毒,最早由我国方定一先生发现鉴定。根据其病毒分类地位,又称鹅细小病 毒。应用中和试验、琼脂扩散试验等方法证明各国分离的毒株具有相同的抗原关系，即目前仅有一种血 清型。小鹅瘟病毒与番鸭细小病毒存在抗原相关性，而与哺乳动物和其他禽类的细小病毒没有抗原相 关性。本病病毒分离常用鹅胚或番鸭胚。鹅胚或番鸭胚原代细胞感染病毒后,用特异的鹅细小病毒多 抗血清或单克隆抗体进行免疫荧光染色，能确定感染细胞内病毒的存在。PCR、双抗体夹心ELISA和 冰冻切片等方法能快速检测病鹅组织样本中的小鹅瘟病毒。 Ⅱ NY/T 560—2018 小鹅瘟诊断技术 1范围 本标准规定了小鹅瘟诊断技术的要求。 本标准所规定的病毒分离方法适用于小鹅瘟病毒分离;多聚酶链式反应(PCR)、琼脂扩散试验、中 和试验、夹心酶联免疫吸附(夹心ELISA)试验、免疫荧光(IFA)试验等诊断方法适用于病毒分离株的鉴 定、鹅群小鹅瘟检疫、流行病学调查和免疫鹅群抗体水平的检测 2 临床症状与病理变化 2. 1 流行病学 专播快。 大 周龄以内的番鸭也可 感染,并发病死亡。 随着日龄增大 逐渐降低。 成年鹅感染 现临庆 未症状。病鹅的 排泄物含有大量病毒，是 是重要的 传染源 2.2 临床症状 S 发病雏鹅精 郁、昏睡 缩头垂翅，食欲减退：病鹅出现稀粪，粪便中含有 气泡或纤维碎片，甚至有 血黏液,肛门附i 症状,并出现抽搐倒地 死亡现象;病程 病急且病 RC 匕率高。 2.3 病理变化 剖检肉眼可见 后段肠管肿胀变粗，肠 同心圆栓塞（肠 栓),易剥离,肠壁 滑且变 ，部分肠道卡他性出血 古钢包 C 肝脏肿大淤 肾脏肿胀，输尿 已尿酸盐沉积;个别病死鹅胰腺有出血点， 鹅脑膜充血或有 出血点。 R 2.4结果判定 符合上述2.1、2 美本特 病例，可以 确诊 鹅 要病原学鉴定。 3病毒的分离、检测和鉴定 3. 1 病毒分离 3.1.1仪器 组织研磨器、恒温孵化箱、手持式照蛋器、 台式离心机(≥10 000 r/min)、一20℃冰 箱、4℃冰箱。 3.1.2耗材 12日龄无小鹅瘟病毒抗体的鹅胚或番鸭胚、眼科剪、镊子、Eppendorf 管（微量离心管）。 3.1.3试剂 0.015mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录A中的A.2)、生理盐水(见A.9)、青霉素(10万 IU/mL)、链霉素(10万IU/mL)。 3.1.4方法及程序 3.1.4.1无菌取患病维鹅或死亡维鹅的肝、脾、肾、肠道等内脏器官,病料放置灭菌的平血中，一20℃保 存，作为病毒分离材料备用。 1 NY/T 560—2018 3. 1.4.2将组织剪碎、磨细,置于1.5mL的 Eppendorf 管中,用含有青霉素和链霉素各2 000 IU/mL 的灭菌生理盐水或灭菌PBS(pH7.2)进行1：10稀释(W/V),37℃作用30min后，8000r/min离心 10min。取上清液经0.22μmol/L滤膜过滤除菌后，作为病毒分离材料。 3.1.4.3鹅胚或番鸭胚接种 将3.1.4.2病毒分离材料接种5枚12日龄无小鹅瘟病毒抗体的鹅胚或番鸭胚,每胚尿囊腔接种 0.2mL,置于37℃～38℃孵化箱内孵化,每天照胚2次,观察9d。 接种后24h内死亡的胚胎废弃,24h以后死亡的鹅胚或番鸭胚取出,置于4℃冰箱内过夜冷却收缩 血管。翌日无菌收获尿囊液,并观察胚体病变。做无菌检验后封装冻存。无菌的尿囊液于一20℃保存， 做传代及检验用。 接种后9d内未见死亡的鹅胚或番鸭胚取出后，置于4℃冰箱内过夜冷却收缩血管。翌日用无菌操 作方法收获尿囊液,盲传一代。 3.1.4.4结果判定 由本病毒致死的鹅胚或番鸭胚具有相同的肉眼可见病变。绒尿膜增厚,全身皮肤充血，翅尖、趾、胸 部毛孔、颈、喙均有较严重的出血点，胚肝边缘出血，心脏和后脑出血，头部皮下及两肋皮下水肿。接种 后7d以上死亡的鹅胚或番鸭胚胚体发育停滞,胚体小。出现以上胚体病变可初步判定为病毒分离阳 性,但需进一步鉴定是否为小鹅瘟病毒。 3.2病毒检测及鉴定 3.2.1琼脂扩散试验 3.2.1.1仪器 灭菌的二重皿、湿盒、打孔器（中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm）、37℃温箱、烧杯、搅拌 棒、电磁炉。 3.2.1.2试剂 标准小鹅瘟阳性血清、小鹅瘟阴性血清、标准小鹅瘟琼脂扩散抗原、琼脂粉、0.015mol/LpH7.2 PB(见A.1)、生理盐水(见 A.9)、氯化钠。 3.2.1.3试验方法及程序 3.2.1.3.1待检小鹅瘟琼脂扩散抗原 制备方法见附录B 3.2.1.3.2琼脂板制备 称取琼脂粉1g,量取100mL的PB(见A.1)或生理盐水（见A.9),置于烧杯中加热融解，琼脂粉溶 解后再加人氯化钠8g，混匀，制成3mm厚的琼脂板。 3. 2. 1. 3. 3打孔 在制备好的琼脂板上用琼扩打孔器进行打孔，并挑出孔中的琼脂。中心1孔，周围6孔，孔径 3mm,孔距4mm,用融化琼脂补孔底。 3.2.1.3.4加样 中央孔加标准阳性小鹅瘟琼扩血清或抗小鹅瘟病毒单克隆抗体；周围1孔加人标准小鹅瘟琼扩抗 原,其他孔加待检抗原。各孔均以加满不溢出为度。将加样后的琼脂板放人填有湿纱布的盒内，置于 20℃～25℃室温或37℃温箱，24h初判,72h终判。 3.2.1.4质控标准 当标准琼扩抗原孔与阳性血清孔之间形成清晰沉淀线时，说明质控合格。 3.2.1.5结果判定 待检抗原孔与阳性血清孔之间也出现沉淀线，且与标准抗原沉淀线末端相吻合，即待检抗原判为 阳性。 2 NY/T 560—2018 待检抗原孔与阳性血清孔或单克隆抗体孔之间无沉淀线出现，即待检抗原判为阴性。 3.2.2夹心酶联免疫吸附试验(夹心ELISA) 3.2.2.1仪器 96孔酶标板、多孔道移液器（50uL～300μL）、单孔道移液器（10μL、200μL、1000μL）、吸水纸、稀 释加样槽、37℃水浴温箱、酶标仪。 3.2.2.2试剂 纯化的抗小鹅瘟病毒单克降抗体、HRP酶标记的不同表位抗小鹅病毒单克隆抗体、标准小鹅瘟 病毒（SYG61株）尿囊液、阴性鹅胚或番鸭胚尿囊液、待检鹅胚或番鸭胚尿囊液（见3.1.4.3）、待检病料 （见附录C）、生理盐水（见A.9）、5%脱脂乳（见A.6）、PBS（见A.2）、PBST（见A.3）、碳酸盐包被缓冲液 （见A.4）、TMB显色液（见A.5 .2mol/LH SO4（见A.10) 3.2.2.3试验方法及程序 B 3.2.2.3.1将小鹅瘟单 克隆抗 51 96孔酶标板中每孔加入 100μL,4℃包被12h 14h 3. 2. 2. 3. 2 用 PBST 3.2.2.3.3加入 脂乳至满 3. 2. 2. 3. 4 用 PBST 5min/次 燥剂并 行密封， 3.2.2.3.5将阴性鹅胚或番甲 胚尿囊液加天A1.A2 孔中，将标准小鹅瘟病 囊液加人A3、A4 孔中,其他待检鹅胚 番鸭胚 下尿囊液或待检病料样本分 5A6等各孔中 孔 37℃水浴作 用1.5h。 3.2.2. 3. 6 用PBS 洗涤 min次 3. 2. 2.3.7 用PBST-稀释酶标单克隆抗体至工 工作浓度，加人上述各孔中，100 37℃水浴作用 1 h。 CE 3.2.2.3.8用 3.2.2.3.9加人 TMB底物显色液，100μL孔 3.2.2.3.10终止： /孔在酶标仪上读取OD n 3.2.2.4质控标准 小鹅瘟病毒标准株 则试验成立。 3.2.2.5结果判定 待检尿囊液或待检病料样品的OLD 298时为 0.298时判为可疑。 3.2.3冰冻切片免疫荧光方法 3.2.3.1仪器 阳离子载玻片、手术刀片、组织包埋器、冰冻切片 37℃水浴培养箱、一20℃冰箱、荧光显微镜。 3.2.3.2试剂 已处