ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 556—2020 代替NY/T556—2002 鸡传染性喉气管炎诊断技术 Diagnostic techniques for avian infectious laryngotracheitis 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T556—2020 簡农业 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替NY/T556一2002《鸡传染性喉气管炎诊断技术》。 与NY/T556一2002相比，除编辑性 修改外主要技术变化如下： “范围"部分增述了聚合酶链式反应（PCR)、荧光定量PCR和琼脂免疫扩散试验方法的适用性； 增加了规范性引用文件（见第2章）； 增加了缩略语（见第3章）； 增加了流行病学、临床症状、剖检变化（见第4章)； 增加了实验室诊断样品采集（见第5章）； 增加了鸡传染性喉气管炎病毒PCR检测方法（见第9章）； 增加了鸡传染性喉气管炎病毒荧光定量PCR检测方法（见第10章）； 增加了诊断结果的判定（见第11章）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。 本标准起草人：蒋文明、刘朔、王素春、于晓慧、李阳、李金平、王静静、彭程、盖文燕、侯广宇、庄青叶、王 楷成、孙淑芳、刘华雷。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： NY/T556—2002。 1 NY/T556—2020 引 鸡传染性喉气管炎（Avianinfectiouslaryngotracheitis，AILT）是一种由α疱疹病毒亚科禽疱疹病毒1 型引起的鸡呼吸道疾病，也可感染野鸡、山鸡和孔雀。该病传播快，死亡率较高，其特征为呼吸困难，咳嗽， 咳出含有血液的渗出物，喉部和气管黏膜肿胀、出血并形成糜烂。目前国内主要使用活疫苗进行免疫，这 由于本病临床症状和观察到的病理变化差异很大，免疫鸡群可排毒或者病毒潜伏感染而不表现临床 症状，激活后可造成发病，难以与其他呼吸道疾病区别。确诊应进行实验室检测，通常检测病原。 近年来，国内外鸡传染性喉气管炎诊断技术发展迅速。一些更为简便和准确的诊断新技术已经成为 鸡传染性喉气管炎诊断和预防的重要依据。本标准的修订参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手 册》（2016版），并结合我国相关技术研究新成果修订，在技术上与国际先进技术保持一致。 II NY/T556—2020 鸡传染性喉气管炎诊断技术 1范围 本标准规定了鸡传染性喉气管炎的临床症状、病毒分离、血清中和试验、琼脂免疫扩散试验、聚合酶链 式反应(PCR)和荧光定量PCR的技术要求 本标准适用于传染性喉气管炎的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查监测。 2规范性引用文件 PUBL 下列文件对于本文件 仅注自期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用 曼新版！ NY/T541 兽 3缩略语 下列缩略语 适用 EID50：鸡肠 感染量 ILT：传染 nlectious Tary ILTV:传 病毒 ctlous PCR：聚合 SPF:无特 TAE:三 lamino acid-ethylene dianin 4临床诊断 4.1流行病学 4.1.1各种年龄和 鸡都 年四 4.1.2潜伏期随流行 株流行时，潜伏期可 缩短至1d~2d。 4.1.3死亡率为5%~70% 4.2临床症状 4.2.1最急性型 4.2.1.1发病突然，呼吸困难，伸颈呼吸，伴随咯咯 4.2.1.2在鸡舍墙壁、地面可见咳出的血凝块。 4.2.1.3传播迅速，发病率高，死亡率可超过50%。 4.2.2亚急性型 4.2.2.1发病较慢，呼吸道症状持续数天。 4.2.2.2与急性型相比，发病率高，但死亡率较低，为10%～30%。 4.2.3慢性型或温和型 4.2.3.1突发咳嗽和气喘，伴有口鼻流液和产蛋下降。 4.2.3.2发病率仅为1%～2%，但大部分的感染发病鸡最终会因室息而死。 4.3剖检变化 NY/T556—2020 4.3.1最急性型 带有血凝块的出血性气管炎，黏液性鼻炎，沿着气管分布带血黏液。 4.3.2亚急性型 气管中有带血或不带血的黏液性渗出物，在喉和气管上部黏膜上附着有黄白色纤维素性干酪样假膜。 4.3.3慢性型或温和型 4.3.3.1可见气管、喉和口腔内有白喉样和干酪样的坏死斑和阻塞物。 4.3.3.2有时可仅有结膜炎、窦炎和黏液性气管炎。 4.4结果判定 符合上述流行病学、临床症状和部检变化的病例，可判为疑似鸡传染性喉气管炎。确诊应采集有临床 症状鸡的组织或血清进行实验室诊断。 5实验室诊断样品采集 5.1器材 5.1.1手术剪刀和镊子。 5.1.2离心管。 5.1.3样品保存管。 5.1.4组织匀浆器。 5.1.5采血器。 5.2试剂 5.2.1生理盐水，配方见附录A中的A.1。 5.2.2青霉素。 5.2.3链霉素。 5.3样品采集 5.3.1生物安全措施 样品采集、保存与运输按照NY/T541的规定执行。 5.3.2组织病料采集 5.3.2.1活禽采样：用灭菌棉拭子深人口咽或气管采集分泌物（以气管为佳），放入含青霉素4000IU/ mL和链霉素4mg/mL的无菌生理盐水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，处理方法同上。 5.3.2.2病死禽采样：无菌采取病死鸡喉头和气管，放入无菌的平皿中，密封保存。 5.3.3血清样品采集 经翅静脉采集鸡血液，每只应不少于1mL。无菌分离血清，装人2mL离心管中，密封后2℃～8℃冷 藏或一20℃冷冻保存。 5.4样品处理 5.4.1棉拭子样品：经剧烈振荡后，10000r/min离心10min，取上清液作为接种材料。 5.4.2组织样品：无菌条件下将组织剪碎，按1：4加人生理盐水（青霉素4000IU/mL和链霉素4mg/ 材料。 6病毒分离 6.1器材 6.1.1组织研磨器。 6.1.2恒温孵化箱。 2 NY/T556—2020 6.1.3 手持式照蛋器。 6.1.4 台式高速离心机。 6.1.5冰箱(2℃~8℃和-20℃)。 6.1.6SPF鸡胚。 6.1.7眼科剪。 6.1.8镊子。 6.1.9离心管。 6.2试剂 6.2.1 生理盐水（见A.1)。 6. 2.2 0.015mol/LpH7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）（见 6.2.3青霉素。 6.2.4链霉素。 6.3鸡胚接种 6.3.1取上清液接种 鸡胚绒毛尿囊膜上 枚鸡胚。置于37℃ 孵育。 6. 3.2 每日照 鸡肝 收集 24h~168h内 死亡的鸡胚和 后仍 的鸡胚见穿绒毛尿囊膜 斑出现 6.3.3有痘斑 汉出鸡 绒毛尿囊膜和尿真液 18℃保 6.3.4无痘斑 取出鸡 胚绒毛尿囊膜和尿囊液 七菌研 冻融3 后离心 日 齿令～12日龄的 鸡胚绒毛尿囊 管炎阴性 6.4结果判定 鸡胚绒毛 膜出型 染性喉气管炎 病毒。 D 血清中和试验 C 7.1器材 R 7.1.1移液器(10 7.1.237℃温箱。 7.1.3灭菌试管。 7.1.4无菌注射器（1mL） 7.2试剂 7.2.110日龄~12日龄SPF鸡胚。 7.2.2灭活的标准阳性血清（中和效价在1：32以上）。 7.2.3标准阴性血清。 7.2.4生理盐水。 7.3试验步骤 7.3.1将病毒分离物用含青霉素1000IU/mL和链霉素1000μg/mL的灭菌生理盐水进行10倍比系 列稀释，分装到2列灭菌试管中。第1列分别加等量的标准阳性血清，第2列分别加等量的标准阴性血 清，将病毒-血清悬液混合并置于冰箱（2℃~8℃)4h。 7.3.2每个稀释度分别接种5枚10日龄～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜，0.2mL/枚，置于37℃孵育。每 日照胚，连续观察7d。收集24h～168h内死亡的鸡胚和168h后仍存活的鸡胚，观察绒毛尿囊膜是否有 痘斑出现。 NY/T556—2020 7.3.3记录观察结果，按半数感染量（Reed-Muench)方法计算EIDso，计算方法见附录B。 7.4结果判定 如分离物能引起鸡胚绒毛尿囊膜出现典型的痘斑，并且经鸡胚中和试验，其阴性血清组和阳性血清组 的EID50的对数之差大于或等于2.0时，则判定分离物为鸡传染性喉气管炎病毒。 8琼脂免疫扩散试验 8.1器材 8.1.137℃温箱。 8.1.2烧杯。 8.1.3搅拌棒。 8.1.4电磁炉。 8.1.5单道移液器（10μL、100μL、1000μL等规格）。 8.1.6灭菌平皿。 8.1.7湿盒。 8.1.8打孔器（中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm）。 8.2试剂 8.2.1标准鸡传染性喉气管炎病毒阳性血清。 8.2.2标准鸡传染性喉气管炎病毒阴性血清。 8.2.3标准鸡传染性喉气管炎病毒琼扩阳性抗原。 8.2.4标准鸡传染性喉气管炎病毒琼扩阴性抗原。 8.2.5琼脂糖。 8.2.60.015mmol/LpH7.2PB(见A.3)。 8.2.7生理盐水（见A.1)。 8.2.8氯化钠。 8.3试验程序 8.3.1琼脂板制备 见附录C中的C.1。 8.3.2打孔、封底 在制备好的琼脂板上用打孔器打孔，并挑出孔中的琼脂。中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4 mm，在火焰上封底。 8.3.3加样 8.3.3.1病原检测 中心孔加人标准鸡传染性喉气管炎病毒阳性血清，第1孔、第4孔加人标准鸡传染性喉气管炎病毒琼 扩阳性抗原和标准鸡传染性喉气管炎病毒琼扩阴性抗原，其他孔分别加入待检样