ICS 11.220 B 41 人N 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 551-2017 代替NY/T551—2002 鸡产蛋下降综合征诊断技术 Diagnostic techniques for egg drop syndrome 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 551—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T551—2002《产蛋下降综合征诊断技术》。与NY/T551—2002相比，除编辑性 修改外,主要技术变化如下： “范围”部分增述了产蛋下降综合征病毒PCR检测方法的适用性； -对血凝和血凝抑制试验进行了修改； 删除了原标准中血清学诊断内容； 增加产蛋下降综合征病毒PCR检测方法。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人：刘胜旺、李慧昕、韩宗玺、王娟、邵昱昊。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -NY/T551—2002。 I NY/T 551—2017 鸡产蛋下降综合征诊断技术 1 范围 本标准规定了产蛋下降综合征的临床诊断和实验室诊断(病毒分离、血凝和血凝抑制试验及PCR 检测方法)的技术方法和实验程序。 本标准适用于鸡产蛋下降综合征的诊断、监测和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 16550新城疫诊断技术 NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 产蛋下降综合征 Eegg drop syndrome,EDS 又名减蛋综合征，是由产蛋下降综合征病毒引起的一种无明显症状、仅表现产蛋母鸡产蛋量明显下 降的疾病。 3. 2 产蛋下降综合征病毒egg drop syndrome virus,EDSV 产蛋下降综合征病毒为腺病毒科、腺胸腺病毒属成员，为20面体对称、无囊膜双链DNA病毒。 4临床诊断 4.1临床症状 4.1.1鸡群在产蛋高峰期(27周龄～49周龄)产蛋下降15%～50%，一般持续4周～10周产蛋逐渐恢 复到正常水平。 4. 1.2鸡蛋破损率 5%~20%。 4.1.3鸡蛋中有较多的畸形蛋、软壳蛋、无壳蛋、薄壳蛋、砂壳蛋,时有水样蛋清，褐壳蛋鸡产浅壳蛋、白壳蛋。 4.1.4不同品种鸡感染时，产褐壳蛋的品种减蛋甚于白壳蛋的品种。 4.2病理变化 本病一般没有明显的特征性病理变化,可见输卵管卡他性炎症，偶见输卵管黏膜水肿和/或腔内有 白色渗出物。 4.3结果判定 鸡群出现4.1中任何一种临床症状和/或剖检出现4.2中的病理变化,可判定为疑似产蛋下降综合 征,应进行实验室确诊。 5实验室确诊 5. 1 病毒分离 1 NY/T 551—2017 5.1.1 试剂 磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH7.2),配制方法见附录A的A.1。 5.1.2样品的采集和处理 按照NY/T541的规定进行样品采集，选择下列1种或2种样品： a): 扑杀疑似EDSV感染鸡,取适量输卵管和卵泡膜样品，研磨。加PBS制成1：5混悬液后冻融 3次，3000g离心10min,取上清，加人青霉素（终浓度为1000IU/mL)和链霉素（终浓度为 1000μg/mL),37℃作用1h。 b）采集劣质蛋清,加等量PBS,并加人青霉素（终浓度为1000IU/mL)和链霉素(终浓度为1000 μg/mL),37℃作用1 h。 5.1.3鸭胚接种及尿囊液收获 0.2mL样品(5.1.2)经尿囊腔接种鸭胚,另设接种 的鸭胚做对照 只，37℃孵育 弃掉48 h内死亡的 鸭胚,收获 48 h～120 h 死亡和存活的鸭胚尿囊液 ING 5. 2 分离物血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验鉴 5.2. 1 血凝试验 5.2.1.1材料 5. 2. 1. 1. 1 96 孔 5. 2. 1. 1. 2 微量移液器。 5.2.1.2试剂 A 5. 2. 1. 2. 1 EDSV 标准 原 5. 2. 1. 2. 2 磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.2),配制方法见 A.2 5. 2. 1. 2. 3 鸡红细 液，配制方法见附录 CEN 5.2.1.3血凝试验操作步 按照GB/ 6550 的规定执行。 5.2.1.3.1 取 BS-25 型微量反应板， 5.2.1.3.2吸取 标准抗原或者待检尿囊液的混悬液加人第1孔中， 打3 次，充分混匀。 5.2.1.3.3从第1孔中吸取 25 μL混匀后的标准抗原或者待检尿囊液加到第 匀后吸取25μL加 人到第3孔，依次进行系列合比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取25μL ［弃之 第12孔为PBS对照。 5.2.1.3.4每孔再加25 5.2.1.3.5每孔加人25μL %的鸡红细胞悬液 5.2.1.3.6振荡混匀反应混合液 20 C～25℃下静置40min后观察 果，或4℃静置60min，PBS对照 孔的红细胞呈明显的纽扣状沉到孔底时判定结果 5.2.1.4结果判定 结果判定细则如下： a）在PBS对照孔出现红细胞完全沉淀的情况下，将反应板倾斜，观察各检测孔红细胞的凝集情 况。以红细胞完全凝集的病毒尿囊液最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度，以使红细胞完全凝 集的病毒尿囊液的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。 b） 如果尿囊液没有血凝活性或血凝效价小于4log2,则用初代分离的尿囊液在SPF鸭胚或非免 疫鸭胚中继续传代两代。若血凝试验检测仍为阴性，则判定产蛋下降综合征病毒分离结果为 阴性。 c）对于血凝试验呈阳性的样品,应采用EDSV标准阳性血清进一步做血凝抑制试验,并与 NDV 2 NY/T 551—2017 和AIV 阳性血清(H7 亚型和H9亚型 AIV阳性血清)进行鉴别诊断。 5.2.2血凝抑制试验 5.2.2.1材料 5.2.2.1.196孔V型微量反应板。 5.2.2.1.2微量移液器。 5.2.2.2试剂 5.2.2.2.1标准抗原：EDSV抗原。 5. 2. 2. 2. 2 标准阳性血清:EDSV标准阳性血清 5. 2. 2. 2. 3 ：其他阳性血清:新城疫病毒(NDV)阳性血清,禽流感病毒(AIV)阳性血清(H7 亚型和 H9 亚型AIV 阳性血清)。 5.2.2.2.4 阴性血清:SPF鸡血清。 RD 5. 2. 2. 2. 5 L,pH 方法顶 5. 2. 2. 2. 6 1%鸡红细胞悬液.配制 附录B 5. 2. 2. 3 4 个血凝单位(4HAU)的 EDSV R 抗原制备 根据5.2.1 L测定的病毒尿囊液的HA效价,推定4HAU抗原的稀释仆 下列方法计算 如尿囊液中病毒抗原的HA效价为91og2，其4HAU为7log 则将尿囊液稀释128倍即 . 可。稀释后,应将制备的4 4HAU进行/HA效价测定以复核验证（见5.2.1） EARC 5. 2. 2. 4 血凝抑制试验操作步骤 5. 2. 2. 4. 1 按照 GBT 16550的规定执行 5. 2. 2. 4. 2 根据Ⅱ 血凝试验结果配制4HAU抗原(见5.2.2.3)。 5. 2. 2. 4. 3 取96 V μL PBS. 5. 2. 2. 4. 4 在第 25 至第 2 倍比稀释至第 10孔，第10孔 生对照，第12 1PBS对照 5.2.2.4.5在第 ul 4HAUEDSV抗原，轻晃反 应板 使反应物混合均匀， 室温下(20℃～25 5.2.2.4.6每孔加 人的 温（20℃ 25 静置40min，或4℃ 静置 60 min。当 PBS 对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。 5.2.2.4.7若血凝抑制效价高于101og2时,可继续增加稀释的孔数。 5.2.2.5与新城疫和禽流感鉴别诊断 应以 NDV 和 AIV 阳性血清对分离物做鉴别诊断,用 NDV 阳性血清和/或 AIV 阳性血清代替 EDSV 标准阳性血清,进行血凝抑制试验(见 5. 2. 2. 4)。NDV 阳性血清和 AIV 阳性血清应不能对分离 物产生血凝抑制,表1中示例结果表示EDSV分离结果阳性。 表 1应用血凝抑制试验鉴定分离物 血 清 抗 原 EDSV 阳性血清 NDV 阳性血清 H7亚型AIV阳性血清 H9亚型AIV阳性血清 分离毒株 + EDSV标准抗原 + 应进行新城疫、禽流感的鉴别诊断。 5.2.2.6结果判定 3 NY/T 551—2017 结果判定细则如下： a）在 PBS对照孔出现正确结果的情况下,将反应板倾斜,判定 HI滴度。HI滴度是使红细胞完 全不凝集(红细胞完全流下)的阳性血清最高稀释倍数。当阴性血清对标准抗原的HI滴度不 大于2log2,阳性血清对标准抗原的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内,并且所用 阴、阳性血清都不自凝的情况下,HI试验结果方判定有效。 合征病毒分离结果为阳性， c）NDV 阳性血清和 AIV 阳性血清应不能对分离物产生血凝抑制。 5.3聚合酶链式反应(ploymerase chain reaction,PCR)检测 5.3.1试剂和材料 5.3.1.1去离子水(dH²O)按照GB/T6682的规定制备。 5.3.1.2PCR扩增用DNA聚合酶(商品化试剂)。 5.3.1.3琼脂糖凝胶(配制