ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 539—2017 代替NY/T539—2002 副结核病诊断技术 Diagnostic techniques for paratuberculosis 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 539—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T539—2002《副结核病诊断技术》。与NY/T539—2002相比，除编辑性修改 外,主要技术变化如下： 修改了范围(见第1章)； 增加了术语和定义（见第2章)； 增加了临床诊断(见第3章); 修改了细菌学检查（见第4章)； 增加了病原分离培养(见第5章); -删除了补体结合试验； 修改了酶联免疫吸附（ELISA)试验（见第7章）； -增加了琼脂扩散试验(见第8章； -增加了副结核病诊断方法的适用性(见附录A)和培养基配制(见附录C) 本标准参考采用世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2016年OIE官方网站 在线版)中的副结核病章节。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、吉林农业大学。 本标准主要起草人：张喜悦、姜秀云、高云航、徐凤宇、范伟兴、孙明军、王伟利、巩红霞、田莉莉、王 岩、赵宏涛。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： NY/T 539—2002。 I NY/T 539—2017 副结核病诊断技术 1范围 本标准规定了副结核病的诊断技术。 本标准的病原分离鉴定、组织病理学和粪便显微镜检查适用于临床病例的确诊;ELISA 和琼脂扩 散试验适用于感染率的流行病学调查以及免疫后个体或群体免疫状态的监测；变态反应试验适用于免 疫状态的监测。 各种诊断方法的适用性见附录 A。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件， 2. 1 副结核病(约内氏病) ) paratuberculosis(Johne's disease) 由禽分枝杆菌副结核亚种引起的反台动物的一种慢性肠炎性疾病。 3 临床诊断 3. 1 临床症状 3.1.1牛的症状表现为进行性消瘦和腹泻，腹泻牛在群中最初是间歇性出现，而后日益增加，直至腹泻 牛在群中不断出现。 3.1.2部分鹿感染后可能突发性腹泻、体重骤降，并在2周～3周内死亡。 3.1.3其他动物可能在无明显腹泻的情况下，几个月后出现极度消瘦。 3.2 病理变化 3. 2. 1临床症状的严重性与病变程度并无密切相关性。 3.2.2牛的小肠和大肠末端黏膜增厚,尤其是回肠末端,应检查其特征性的增厚和皱褶病变。早期病 变可于强光下观察到散在的蚀斑。 3.2.3鹿的小肠和大肠末端可见黏膜充血、糜烂和瘀斑。 3.2.4山羊、绵羊的肠系膜淋巴结可见干酪样坏死或钙化， 3.2.5增生性肠炎病变样品经固定(10%福尔马林）、切片、苏木紫一伊红染色，病变可见黏膜固有层浸 润、淋巴集结和肠系膜淋巴结皮质有大的淡染上皮样细胞和多核朗罕氏巨细胞浸润;经姜一尼氏染色， 可见两种细胞中有成丛的或单个的抗酸菌。 3.3流行特点 3.3.1该病常见于家养和野生反动物。 3.3.2该病主要经消化道感染,也可垂直传播给胎儿。 3.3.3初次感染禽分枝杆菌副结核亚种的牛群中，首先是2岁～3岁的牛出现症状。当牛群持续感染 1年～2年后,任何年龄段的牛均可出现症状,但3岁～5岁奶牛的病例较多。 3.4结果判定 反台动物出现3.1的临床症状、具有3.2的病理变化并符合3.3的流行特点时,可判为临床诊断 阳性。 1 NY/T 539—2017 4病原显微镜检查 4.1材料准备 4.1.1器材 水浴锅、离心机、显微镜和载玻片。 4.1.2试剂 0.5%氢氧化钠溶液(0.5%NaOH)、姜一尼氏染色（Ziehl-Neelsen染色、ZN染色）试剂（配制及染 色方法见附录B)。 4.2操作方法 取待检粪样(尽可能取带有黏液或血丝的粪便)15g～20 0g,加人约3倍体积的0.5%NaOH溶液， min 离心 30min,去上清,用沉淀涂片也可以直肠刮取牧 氏染色后镜检。 ING 4.3结果判定 RESE 4.3.1阳性 A 在细胞内有被染成红色 成从成团（≥3个 )的抗酸短杆菌（0.5 m）即 为显微镜检查 S 阳性。 SEARCH 4.3.2阴性 未出现4.3. 的结果则判为显微镜检查阴性 R 5 病原分离培养 U 5.1材料准备 5.1.1器材 磁力搅拌 器 离心机、恒温培养箱、显微镜和载玻片 5.1.2试剂 C 胰蛋白酶(2 .95%的氯化十 六烷基吡啶 [errold's或改良 Dubos's 培养基(配制) 5.2样品准备 5.2.1组织样品 为防止污染,用无菌盐水冲洗样本肠道中的粪便。采集 样品应一20℃保存，不得使用防腐剂。 从回盲瓣、肠系膜结节或其他病变区刮取 4 g黏膜,装人含50mL胰蛋白酶(2.5%)的无菌容器中。 用 4% NaOH调整pH至中性,室温下磁力搅拌 30min,用纱布过滤后2000g～3000g离心30min,弃 去上清。沉淀用 20 mL 0.75% HPC 重新悬浮,室温静置 18 h。底部的沉淀即为接种物。 5.2.2粪便样品 粪便样品处理前应一70℃冻存，不得使用防腐剂。 将1g粪便放人装有20mL无菌蒸馏水的50mL试管中，室温振荡30min，静置30min。取最上层 的5mL悬浮液，加至含有20mL0.95%HPC的试管中，混匀后室温直立静置18h。试管底部的沉淀 即为接种物。 5.3接种培养 取100μL接种物,分别接种3个含分枝杆菌素和1个不含分枝杆菌素的Herrold's培养基,将样品 均匀接种于斜面。将试管螺帽拧松后于37℃斜面放置约1周，当水分从斜面上蒸发以后，将试管螺帽 紧后垂直放置。37℃培养6个月，从第6周起，每周观察1次。 2 NY/T 539—2017 5.4生长特性 初代培养会在接种后5周至6个月长出菌落,在含有分枝杆菌素的Herrold's培养基上，禽分枝杆 菌副结核亚种的初始菌落很小（0.25mm～1mm），无色、半透明、半球状、边缘整齐、表面光滑、有光泽， 随着时间延长，菌落变大(可达2mm）,不透明，菌落的形态从光滑变为粗糙，从半球状变为乳头状。 5.5结果判定 如在含有分枝杆菌素的Herrold's培养基或含有分枝杆菌素的改良Dubos's培养基上有符合禽分 枝杆菌副结核亚种特性的菌生长，而在不含分枝杆菌素的培养基上无菌生长，镜检为抗酸染色阳性的红 色成丛杆菌，出菌时间较长，且 PCR鉴定为阳性(参见附录D、附录E),判为禽分枝杆菌副结核亚种培 养阳性。 6皮内变态反应试验 6.1材料准备 6.1.1器材 游标卡尺、灭菌的1mL注射器或连续注射器、针头和75%酒精棉。 6.1.2试剂 禽分枝杆菌副结核亚种提纯蛋白衍生物（副结核PPD)或禽分枝杆菌提纯蛋白衍生物（禽结核 PPD)。 6.2操作方法 6.2.1记录被检动物编号，在颈侧中1/3处的健康皮肤处剪毛，直径约10cm，用手捏起注射部位的皮 肤，以游标卡尺测量皮肤皱褶厚度并记录，之后局部消毒。 6.2.2将副结核PPD或禽结核PPD以灭菌生理盐水稀释至0.5mg/mL,针头与皮肤呈15～20°的角 度进行皮内注射。无论动物种类及大小一律注射0.1mL。注射后,注射部位应呈现绿豆至黄豆大小的 小包。如注至皮下或溢出,应于离原注射点8cm以外处补注一针,并在记录中注明。 6.2.3牛、羊也可在尾根无毛的皱褶部进行皮下注射。 6.3结果判定 6.3.1判定方法 注射72h后观察反应，检查注射部位有无红、肿、热、痛等炎性反应，并以游标卡尺测量注射部位的 皮肤皱褶厚度。 6.3.2判定标准 具体判定标准如下： a）变态反应阳性（十）:局部有炎性反应,皮皱差≥4 mm; b）变态反应疑似(±):局部炎性反应不明显,皮皱差为 2. 1 mm～3. 9 mm; c）变态反应阴性（一）:局部无反应或炎性反应不明显,皮皱差≤2.0 mm。 6.3.3疑似反应的判定 变态反应疑似,应于3个月后复检。复检时，应于注射部位对侧的相应部位进行皮下注射，72h后 仍为变态反应疑似的,则判为变态反应阳性。 6.3.4其他情况的判定 尾根试验中有反应者(不论皮皱差大小和炎性反应轻重)均判为变态反应阳性（十），鹿有任何形式 的肿胀均判为变态反应阳性（十）,无任何反应者判为变态反应阴性（一）。 7酶联免疫吸附试验 7.1材料准备 3 NY/T 539—2017 7.1.1器材 酶标仪、恒温箱和加样器等。 7.1.2试剂 禽结核分枝杆菌副结核亚种抗原包被板、酶标抗体、阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液（含 草分枝杆菌吸收抗原）、洗涤液、底物溶液和终止液等ELISA试剂。上述试剂应于2℃～8℃保存，使用 前恢复至室温（18℃～26℃）。 7.2操作方法 7.2.1血清处理 将待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清,使用血清稀释液(含草分枝杆菌吸收抗原)进行稀释， 混匀后37℃作用30min或室温（18℃~ ℃)作用 应用草分枝杆菌吸收抗原去除血清中的非特异 性反应成分。 7.2.2加样 ARD 作用30min 6℃)作用1h,使用 洗涤液洗涤3次， 7.2.3加入酶标抗体 将酶标抗体稀释至工作浓度后加人酶标板中， 每孔100 ，37℃作用 成室温（18℃～26℃） 作用1h，使用洗涤液洗涤 7.2.4加入底物溶液 每孔加人 100 μLATM MB