ICS 11.220 CCSB41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4043—2021 中华蜜蜂囊状幼虫病诊断技术 Diagnostic techniques for sacbrood disease of Chinese honeybee (Apis cerana cerana) 2021-12-15 发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T4043—2021 永林品食业沐国全 目 限共公 前言 引言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 缩略语· 5 临床诊断 5. 1 感染特点 5. 2 箱外观察 5. 3 开箱检查 5.4 流行特点 5.5 结果判定 6实验室诊断 6.1采样. 6.2电镜法鉴定 6.3反转录-聚合酶链式反应扩增(RT-PCR)鉴定 6.4荧光定量PCR鉴定 7综合判定 7.1CSBV病原检测结果判定 7.2CSBD检测结果判定…. 附录A（资料性）中华蜜蜂囊状幼虫病 附录B（资料性）溶液配制方法· 附录C（资料性）病毒粒子分离纯化 附录D(资料性） PCR检测用引物和探针、反应体系及反应条件 I NY/T4043—2021 全国农业食品标准 前率言 公共服务 食典通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本文件起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所。 本文件主要起草人：徐书法、武江利、李南南、于慧敏、刘彦杰、徐进、李小英， I NY/T4043—2021 引言 中华蜜蜂囊状幼虫病（Chinesesacbrooddisease，CSBD）是由中华蜜蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbroodvirus,CSBV)引起的一种可导致大量中华蜜蜂幼虫死亡的烈性传染病，简称中蜂囊幼病，是危害 中华蜜蜂的主要病害之一。恶劣的气候和环境、不充足的蜜粉源和不科学的管理技术是造成囊状幼虫病 暴发的主要诱因。患囊状幼虫病的蜂群，通常导致3日龄～4日龄的幼虫死亡。该病典型症状表现为幼 虫体色逐渐由珍珠样白色变黄、黄褐、褐，甚至黑色，后期虫体软化，大量的液体聚积于病虫躯体和未脱去 的表皮之间，从巢房中拖出病死幼虫呈小囊状。 定量PCR检测方法)的技术要求，可对中华蜜蜂囊状幼虫病进行综合诊断， NY/T4043—2021 中华蜜蜂囊状幼虫病诊断技术 1范围 本文件规定了中华蜜蜂囊状幼虫病的临床初步诊断以及电镜法鉴定、反转录-聚合酶链式反应扩增 (RT-PCR)鉴定、荧光定量PCR鉴定的实验室诊断技术。 本文件适用于中华蜜蜂囊状幼虫病的诊断和病原检测 2 规范性引用文件 DUBL 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于 本文性不注 包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682 分析实验室用 试验方法 GB/T 3473 17 蜜蚂 CR NY5138 20 S 3术语和定义 下列术语和定 定义适月 文件 R 3. 1 中华蜜蜂囊状 伏幼虫病 Ldisease 由囊状幼虫光 3. 2 子脾brood comb 巢房内以蜜蜂卵 3.3 花子 spotty 同一子脾平面 的幼 巢房相间排列的状态。 3. 4 穿孔punch 蜜蜂子脾上的封盖子由于 后巢房内 常或死 勤蜂啃咬而造成巢房盖上出现小 孔的现象。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CSBD：中华蜜蜂囊状幼虫病(Chinesesacbrooddisease，CSBD) CSBV：中华蜜蜂囊状幼虫病毒（Chinesesacbroodvirus，CSBV) DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate） dNTP：三磷酸脱氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleoside-5'-triphosphate) EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid) PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersolution) PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction) SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate) NY/T4043—2021 TAE:Tris-乙酸-EDTA(Tris-acetate-EDTA) 5临床诊断 5.1感染特点 CSBV主要感染1日龄3日龄幼虫。感病幼虫于封盖前后死亡，其中约有1/3死于封盖前，2/3死 于封盖后（见附录A)。 5.2箱外观察 早晨蜜蜂开始活动时，若发现箱前有蜜蜂从巢内拖出幼虫及预蛹期呈“尖头”状尸体。 5.3开箱检查 5.3.1花子、房盖穿孔 患病初期蜂群出现蜂王产卵量减少，蜂群骚乱，情绪暴躁现象。提出子脾观察，发现蜂群内的子脾表 现为花子、穿孔。病害严重期，病虫数量多，脾面上可见部分幼虫的体色逐渐由珍珠白色变黄色、黄褐色、 褐色，甚至黑色。伴随体色变化，虫体逐渐软化，体壁内出现大量的液体。 5.3.2幼虫死亡 患病蜂群巢房内有死亡大龄幼虫，从巢房中夹出病死幼虫呈囊袋状；随虫体水分蒸发，干枯成黑褐色 户体，头、尾部略上翘，形如“龙船状”。 5.4流行特点 5.4.1流行时间 南方和北方CSBD的流行有时间差异。南方CSBD常出现在3月～4月和11月～12月，北方则在 4月～5月和8月～9月。蜂群因长期无法培育新成年蜜蜂，最终导致蜂群快速衰弱、飞逃或消亡。 5.4.2传播途径 5.4.2.1群内传播 成年蜜蜂因清理感病幼虫而被感染，感病的成蜂则通过饲喂幼虫，将病毒传染给健康幼虫，导致更多 幼虫患病。 5.4.2.2群间传播 主要通过盗窃、迷巢等行为方式与感病蜜蜂接触而传染。 5.5结果判定 结合该病的流行特点，若蜂群出现5.2和5.3的典型症状，即可初步判定为CSBD疑似阳性。 6实验室诊断 6.1采样 6.1.1采样比例 当蜂群数量小于或等于10群时，对所有蜂群均采样。当蜂群数量在10群以上时，以10群为基础采 样量，每增加10群，采样量增加1群。采样时，每个蜂群取10只～20只幼虫。 临床诊断时，若发现蜂群疑似感染CSBD，可根据实际情况增加采样比例，同时采集疑似感染个体。 6.1.2采样方法 根据临床诊断结果，选择疑似感染的蜂群采集蜜蜂幼虫样品。采样时，应尽量无菌采集变色或死亡幼 虫，样品保存于2℃～8℃的条件下，24h内送实验室检测。长期保存要经液氮处理后于一80℃冰箱 保存。 6.2电镜法鉴定 6.2.1病毒分离纯化 采集疑似的CSBD中华蜜蜂幼虫样品，加入等量的0.03mol/L磷酸盐缓冲液（见附录B中的B.2)和 1/4体积四氯化碳，充分研磨至匀浆。蔗糖密度梯度离心，纯化提取液（见附录C)。 2 NY/T4043—2021 6.2.2典型特征 将纯化后的提取液负染后用于制备电镜片。电镜下观察，可见大量圆形病毒颗粒，接近球状的六边 形，直径约28nm（见图C.1) 6.2.3结果判定 如电镜观察到CSBV典型特征，可判为疑似阳性。 6.3反转录-聚合酶链式反应扩增(RT-PCR)鉴定 6.3.1试剂 6.3.1.110×PCR反应缓冲液（含15mmol/L 6.3.1.25×反转录酶缓冲液。 6.3.1.375%乙醇。 PUBLI 注：用新开启的无水乙醇 DEPC 配制 6.3.1.4DEPC水，配 制方法 6.3.1.5 DNA聚合 证 6.3.1.6dNTPs 6.3.1.7 RNA 剂0 6.3.1.8反转 S 6.3.1.9 氯仿 URAL 6.3.1.10 6.3.2器材 6.3.2.1 1. 6.3.2.2 凝胶 像系统 6.3.2.3普通 CR仪 6.3.2.4琼脂糖 凝胶电 6.3.3样品材料 6.3.3.1 CSBL 时照 SBV阳EEE 6.3.3.2CSBD 照 床症状的幼虫作 6.3.4制备样品RNA( 6.3.4.1采集具有C 疑似症 液氮条 下充分研磨病料组织。 6.3.4.2取0.1g充分研磨后的组织 加天mL TRIzol提取液，室温放置5min， 使其充分裂解。 6.3.4.3于12000g离心5min，取上消 6.3.4.4加入200μL氯仿，振荡混匀后室温放置15mi 6.3.4.54℃，12000g离心15min，取上层水相，转移至另一离心管。 6.3.4.6 按异丙醇：TRIzol=1：2(V/V)的比例加人异丙醇混匀，室温放置5min～10min。 6.3.4.74℃条件下12000g离心10min，弃上清液。 6.3.4.8加入1mL75%乙醇（DEPC水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。 6.3.4.94℃条件下8000g离心5min，弃上清液。 6.3.4.10 室温晾干或真空干燥5min~10min。 6.3.4.11 用50μL无RNase水，TEbuffer或0.5%SDS溶液重悬RNA样品，储存于一20℃备用。 6.3.5cDNA合成 6.3.5.1在离心管中依次加人随机引物2μL，无RNase水12μL;轻微振荡，瞬时离心。 3