ICS 11.220 CCS B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4041—2021 水貂阿留申病诊断技术 Diagnostic techniques for aleutian mink disease 2021-12-15 发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 4041—2021 目 次 前言 引言 1. 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 缩略语· 5 临床诊断 5. 1 临床症状 5. 2 病理诊断 5. 3 结果判定 6 PCR检测 6. 1 仪器. 6. 2 试剂 6.3 AMDV阴性对照和阳性对照样品的制备 6. 4 样品的采集和处理 6. 5 操作方法 6. 6 质控标准 6.7 结果判定 实时定量PCR检测 7. 1 仪器. 7. 2 试剂 7. 3 AMDV阴性对照和阳性对照样品的制备.. 7. 4 样品采集和处理 7. 5 操作方法 7. 6 质控标准 7. 7 结果判定 8 CIEP检测 8.1 仪器. 8. 2 耗材· 8.3 试剂 8. 4 阴性对照和阳性对照样品的制备 8.5 样品采集和处理 8. 6 操作方法 8.7 质控标准 8.8 结果判定 ELISA检测 9. 1 仪器. 9. 2 试剂 9.3 包被抗原 9. 4 NY/T 4041—2021 9.5样品采集和处理. 9.6操作方法 9.7质控标准 9.8结果判定 10综合判定 附录A（资料性）AMDVPCR检测引物、溶液的配制、电泳示意图及扩增产物序列 附录B(资料性） 实时定量PCR扩增引物、探针和扩增序列 附录C(资料性） CIEP实验溶液的配制、打孔模型图及电泳结果图示.. 附录D(资料性） ELISA实验溶液配制 12 II NY/T4041—2021 公共服务 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 院、长春海关、哈尔滨国生生物科技股份有限公司、中国兽医药品监察所、青岛农业大学 本文件主要起草人：张蕾、刘昊、陆涛峰、张海玲、程悦宁、赵传芳、王伟利、胡博、朱言柱、邓效禹、闫喜 军、廉士珍、王振军、董明奇、曲会、陈洪岩、徐磊、印春生、孟庆峰、单虎、杨瑞梅。 NY/T 4041—2021 家补品食业 言欢国全 引 水貂阿留申病（Aleutianminkdisease)又称浆细胞增多症或高球蛋白血症，是由水貂阿留申病毒 （Aleutianminkdiseasevirus，AMDV)引起水貂（Neovisonvison）的一种免疫抑制性疾病。幼貂感染后可 急性死亡，成年水貂感染后多呈慢性经过，患病水貂进行性消瘦，毛皮质量差，繁殖能力下降。该病在世界 各水貂养殖国家广泛流行。 IV NY/T4041—2021 水貂阿留申病诊断技术 1范围 本文件规定了水貂阿留申病的临床诊断、PCR检测、实时定量PCR检测、对流免疫电泳和ELISA检 测的操作方法和技术要求。 本文件适用于水貂阿留申病的诊断，检疫监测和流行病学调查， 2规范性引用文件 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于 包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682 实验空用 NY/T 541 兽医诊断样品 技术规 3术语和定义 S 本文件没有需 要界定 RA 4缩略语 下列缩略 适用于 AMDV 招阿留申 CIEP:对 电疫电污 CRFK：猫肾 细胞 Ct：每个反 ELISA：酶 交吸除 OD：光密度 PCR：聚合酶链 5临床诊断 5.1临床症状 5.1.1幼貂常呈急性经过，病程短优 促，腹式呼吸，突然死工 5.1.2成年水貂常呈慢性经过，进行性消瘦， 猛增，暴饮，厌食。公貂性欲下降或死精、少精、产生畸 形精子。母貂不孕或流产，仔貂成活率低。 5.1.3个别水貂表现出神经症状，痉挛、步态螨珊、共济失调或后肢麻痹等。 5.2病理诊断 5.2.1户体消瘦、贫血，内脏出血。 5.2.2幼貂肺水肿。肺泡间质增厚、出血，肺泡Ⅱ型细胞内可见包涵体。 5.2.3成年水貂肾、脾肿大。肝、脾、肾等多个组织内均可见血管周围浆细胞浸润。 5.2.4怀孕期可见死胎、木乃伊胎、子宫出血。 5.3结果判定 本病多呈隐性感染，临床症状进程缓慢且不典型，易与其他疾病相混淆。根据临床症状或病理诊断可 做出初步诊断，确诊须通过实验室进行。 1 NY/T4041—2021 6PCR检测 6.1仪器 6.1.1微量移液器(0.5μL~10μL、2μL～20μL、20μL～200μL)及其配套吸头。 6.1.2小型台式离心机（最大离心力在12000r/min以上）。 6.1.3涡旋混匀器。 6.1.4PCR扩增仪及与其配套的PCR管。 6.1.5电泳仪。 6.1.6电泳槽。 6.1.7紫外线凝胶成像仪。 6.2试剂 6.2.1除特别说明外，本文件所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682的规定。 6.2.2非结构蛋白NS1基因保守区引物（浓度为10pmol/μL，见附录A中的A.1)。 6.2.3TagDNA聚合酶（5U/μL)及配套的10XPCR缓冲液。 6. 2. 4 dNTP(2. 5 mmol/L)。 6.2.5DL2000DNAMarker。 6.2.61XTAE电泳缓冲液(见A.2.1)。 6.2.7商品化无毒核酸染料。 6.2.86X核酸电泳上样缓冲液， 6.2.9 91%琼脂糖凝胶（见A.2.2）。 6.3AMIDV阴性对照和阳性对照样品的制备 CRFK传代细胞培养物，反复冻融2次～3次，5000r/min离心10min，取上清液作为阴性对照样 品。国际参考毒株AMDV-GCRFK传代细胞培养物反复冻融2次～3次，煮沸后5000r/min离心 10min，取上清液作为阳性对照样品。 6.4样品的采集和处理 患病动物的脾、肾和血液按NY/T541的规定执行。 6.5操作方法 6.5.1DNA提取 6.5.2PCR反应体系 在0.2mLPCR管中依次加人以下试剂： 10XPCR缓冲液 2.5 μL dNTP(2. 5 mmol/L) 2. 0 μL 正向引物（10pmol/μL） 1.0 μL 反向引物（10pmol/μL） 1. 0 μL 模板DNA(10ng/μL~100ng/μL) 1. 0 μL TaqDNA聚合酶 0.5 μL 灭菌蒸馏水 17.0μL 同时设阴性对照及阳性对照。总体系为25μL，用涡旋混匀器进行混匀，瞬间离心10s备用。 6.5.3扩增程序 将PCR反应管置于PCR扩增仪按如下程序扩增：94℃预变性5min，35个循环（94℃变性30s、 55℃退火30s、72℃延伸30s)，最后72℃延伸7min。 2