ICS 11.220 CCS B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4035—2021 鸡滑液囊支原体感染诊断技术 Diagnostic techniques for Mycoplasma synoviae infection 2021-12-15发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T4035—2021 家沐品会业弥国全 目次 前言 引言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 临床诊断 5 实验室诊断 6综合判定 附录A（资料性） 鸡滑液囊支原体分离鉴定溶液的配制 附录B（资料性) 鸡滑液囊支原体的分离鉴定. 附录C(资料性) qPCR的特异性扩增序列(119bp）. 附录D(资料性) 实时荧光定量PCR阳性质粒的制备及标准曲线的建立 附录E(资料性) 鸡滑液囊支原体MSBP蛋白抗原的制备 附录F（资料性) 鸡滑液囊支原体阳性对照血清的制备.. 13 附录G(资料性) 鸡滑液囊支原体阴性对照血清的制备 附录H（资料性) 间接ELISA实验溶液的配制 NY/T 4035—2021 全国农业食品标准 前务平言 公共服务 厂食典通 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本文件主要起草人：宫晓炜、郑福英、陈启伟、刘永生 II NY/T4035—2021 引言 鸡滑液囊支原体（Mycoplasmasynouiae，MS)感染是由鸡滑液囊支原体引起的鸡、火鸡和珍珠鸡的传 染病，又称鸡传染性滑膜炎（avianinfectioussynovitis）。MS可通过直接或间接接触水平传播，也可经种 蛋垂直传播，以4周龄～12周龄的鸡和10周龄～12周龄的火鸡多发，成年鸡和幼龄鸡也可发生。病鸡临 床上主要表现为精神沉郁，采食减少，喜卧，关节和趾关节明显肿胀、变形，跛行，胸部囊肿和蛋壳尖端畸 形。特征性病变为关节积液，滑液囊和肌腱发炎，实质器官肿大，部分病例出现气囊炎。当合并感染新城 疫病毒、传染性支气管炎病毒或大肠杆菌等病原时，会引起鸡的免疫抑制，从而使病情加重甚至死亡。 本文件规定了鸡滑液囊支原体感染的临床诊断和实验室诊断（鸡滑液囊支原体的分离鉴定、实时荧光 定量PCR核酸检测方法和间接ELISA抗体检测方法）的技术要求，可对鸡滑液囊支原体感染进行综合 诊断。 NY/T4035—2021 鸡滑液囊支原体感染诊断技术 1范围 本文件规定了鸡滑液囊支原体感染的临床诊断，病原的分离鉴定、实时荧光定量PCR核酸检测和间 接ELISA抗体检测的技术要求。 本文件适用于鸡滑液囊支原体感染的临床诊断和实验室检测。 2规范性引用文件 本文件没有规范性引 用文件 3术语和定义 下列术语和定 3. 1 SP4培养基 用于培养 液囊支 3. 2 L 实时荧光定量 EPCR tim fluorese entquantitativ 在 PCR 最后 通过荧光信号 对未知模板进行 定性分析 对未知模板进行定量分析的方 3. 3 间接ELISA indirect enzyme Jinked immunosorbent as sa 将抗原连 固相载体 ，样品中 与抗原 形成 酶7 复合物中的抗体 结合，最后加入 3. 4 每个反应管内的荧光后号室 4临床诊断 4.1流行特点 4.1.1鸡、火鸡和珍珠鸡易感，鸭、鹅、鸽、鹑也可感染，以4周龄 ～12周龄的鸡和10周龄～12周龄的 火鸡多发，成年鸡和幼龄鸡也可发生。 4.1.2主要经直接或间接接触水平传播，也可经种蛋垂直传播。 4.1.3潜伏期为8d~10d。 4.1.4本病的急性感染期持续时间短，而慢性感染持续时间长，可终身带菌。 4.1.5生物安全体系不完善，饲养环境不良，如密度过大、空气不流通、潮湿、过冷，以及与其他致病因子 混合感染，均可加重本病的感染程度。 4.2临床症状 4.2.1病鸡表现为精神沉郁，鸡冠苍白、萎缩，不食或少食，排绿色稀便，消瘦，最后衰竭死亡。 4.2.2病鸡表现为关节肿胀，跛行，喜卧。 4.2.3 蛋鸡产蛋率下降，部分蛋壳尖端畸形。 1 NY/T4035—2021 4.3剖检病变 4.3.1关节滑液囊和肌腱发炎。 4.3.2关节和趾关节积液。 4.3.3呼吸系统感染出现气囊炎。 4.4结果判定 符合4.1中描述的某些流行特点，病鸡出现4.2中的部分临床症状和4.3中的部分眼观病变，可判断 为疑似鸡滑液囊支原体感染。 5实验室诊断 5.1样品采集、保存与运输 5.1.1样品采集和处理 5.1.1.1每个发病鸡群选择10只以上病鸡采集样品。 5.1.1.2采集血清样品时，选择具有临床症状的活鸡，颈静脉、翅静脉或心脏无菌采集血液1mL～ 2mL,3500r/min~4000r/min室温离心5min分离血清。 5.1.1.3棉拭子和组织样品 5.1.1.3.1活鸡可用无菌棉拭子从喉头进行取样，根据用途不同，进行以下不同处理： a）用于分离培养的样品，放人含4.5mLSP4液体培养基（见附录A中的A.2)的无菌离心管中； b）用于提取DNA的样品，放人含1mLHIbuffer见A.4)的无菌离心管中。 5.1.1.3.2死亡鸡可用无菌棉拭子沾取肿胀足垫、关节黏液或气囊干酪样物取样： a）用于分离培养的，放入含4.5mLSP4培养基（见A.2)的无菌离心管中； b）用于提取DNA的，放人含1mLHIbuffer（见A.4)的无菌离心管中。 5.1.2样品的运输与保存 5.1.2.1用于鸡滑液囊支原体分离培养的棉拭子和组织样品，采集后立即放人4.5mLSP4液体培养基 中，然后置于冰上冷链运输，24h内送往实验室。 5.1.2.2用于DNA提取的棉拭子和组织样品置于冰上冷链运输，到达实验室后一20℃以下冻存。 5.1.2.3血清置于冰上冷链运输，到达实验室后一20℃以下冻存。 5.2病原的分离鉴定 5.2.1仪器 5.2.1.1电子天平。 5.2.1.2光学显微镜。 5.2.1.3恒温培养箱。 5.2.2耗材 5.2.2.210mL无菌离心管。 5.2.2.3涂布棒。 5.2.2.40.45μm滤器。 5.2.2.5 一次性培养皿。 5.2.3试剂 5.2.3.1酵母浸出液，见A.1。 5.2.3.2 SP4液体培养基，见A.2。 5.2.3.3SP4固体平板，见A.3。 5.2.3.4HI buffer,见A.4。 2 NY/T4035—2021 5.2.4病原的分离 5.2.4.1将放入4.5mLSP4液体培养基中的棉拭子用力搅拌挤压后弃之，离心管放人5%CO2培养箱 中，37℃培养 5.2.4.2培养24h后，将SP4液体培养物按1：10的比例转接新的液体培养基中培养，直至培养基pH 下降，颜色由红色变为黄色（若培养基变混浊，用0.45um滤器过滤除菌），用接种环蘸取培养物划线于 SP4固体平板。 5.2.4.3上述SP4固体平板放置于湿盒中37℃培养5d～7d，低倍镜下观察菌落的生长情况，用接种环 挑取平板上的疑似鸡滑液囊支原体菌落接种到SP4液体培养基中培养，直至培养基pH下降，颜色由红色 变为黄色，再将变黄的培养物划线接种到SP4固体平板上。重复该步骤，直至得到鸡滑液囊支原体特征 性菌落。 5.2.4.4将特征菌落接种到 SP4液体培养基中培养B音养基颜色变黄后，用 用0.45um滤器过滤液体培养 物；转接200μL滤液到 1.0 ）：将SP4固体平板划为8 等份，依次取5L原液和不同浓度的稀释 5.2.4.5上述SP 固体 平板在 低倍显 境 观察到分布均匀的菌 落，选取单个菌落 于液体培 基 养，直至培养基由红色 固体平板。如此重 复3次，即可得 化的菌株 加丰池 RESEA 印约纯 5.2.5 病原的形态观） 5.2.5.1菌落特征 用低倍显微 竞观穿， 代可星 边透明的“油煎蛋” RC 样菌落（见附 录 5.2.5.2染色镜 检 用吉姆雨 色星淡 杆状工直 经约0.2um，长约 0.4μm(见B 5.2.6病原的生 化鉴定 5.2.6.1葡萄糖 发酵实验 将5.2.4.5 化的菌 色变为黄色，表明 纯化的菌株发酵 5.2.6.2精氨酸水 将5.2.4.5纯化 殊接利 精氨酸的支原体培养基 音养 艺没有从黄色变为红色， 表明纯化的菌株不水解精氨酸，培养基 5.2.6.3尿素实验 将5.2.4.5纯化的菌株接种于 下含葡萄糖和精氨酸、而是加人含 0.1%尿素的pH5.5~6.0的支原 体培养基中，培养基颜色没有从黄色变为红色，表 明纯化的菌株不水解尿素， 5.2.7病原的鉴定 符合菌落特征和生化特征的菌株，按照5.3做实时荧光定量PCR检测。 5.2.8结果判定 菌落特征明显，符合生化反应特性，参照5.3鉴定结果阳性，判定为鸡滑液囊支原体分离阳性；否则， 判定为未检出鸡滑液囊支原体。 5.3实时荧光定量PCR方法 5.3.1仪器 5.3.1.1实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管。 5.3.1.2离心机。 3