ICS11.220 CCSB41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4031—2021 动物源性食品中住肉抱子虫检测方法 Detection methods of Sarcocystis spp. in animal-derived foods 2021-12-15发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T4031—2021 全国农业食品标 公共歇 言 通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本文件起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所、云南大学生命科学学院。 本文件主要起草人：陈兆国、米荣升、黄燕、龚海燕、张烨华、胡俊杰。 I NY/T4031—2021 动物源性食品中住肉孢子虫检测方法 1范围 本文件规定了动物肌肉中住肉孢子虫包囊检查和PCR检测方法的技术要求。 本文件压片镜检法适用于牛、羊、猪、马等动物肌肉中住肉孢子虫的检测；PCR法适用于黄牛中寄生 的隆美尔住肉孢子虫（S.rommeli），水牛中寄生的德宏住肉孢子虫（S.dehongenhsis），耗牛中寄生的枯 氏住肉孢子虫（S.cruzi）、莱氏住肉孢子虫（S. fusiformis、人住肉孢子虫（S. bovini），山羊中寄生的山羊 犬住肉孢子虫（S.capra ，绵羊中寄生的柔嫩住肉孢子虫（S. tenella）、白羊犬住肉孢子虫 S S ertrami），猪中寄生的米 氏住肉孢子虫（S. 2规范性引用文 RE 下列文件中 TES 容通过 日期的引用文件， 本适用 仅该日期对应的版 不文件不期的用 单）适用本文件。 GB/T 6682 分析实 室用水规格和试验 2002 WS/T230 R 3术语和定义 U 本文件没有 君要界危的 CEN 4缩略语 下列缩略语适 用甲本 corl：线粒体 chono it1)基因 DNA：脱氧核 T EB：溴化乙锭（ idiun PCR：聚合酶链式 (Poly) PBS：磷酸盐缓冲液（Pho TAE：Tris-乙酸电泳缓冲沼 5样品的采集、保存和运输 5.1样品的采集 根据不同动物肌肉的具体情况，每头动物采集体一个部位或多个部位肌肉，尤其注意采集这些肌肉 中有米粒状包囊的肌肉样品，记为一份肉样，其质量不少于50g。 5.2样品的保存和运输 5.2.1采集的样品，不超过24h检测的，在2℃～8℃条件下保存即可；1月以内检测的，存放温度不高 于一20℃；超过1个月检测的，存放于一80℃以下冰柜，或浸泡在福尔马林溶液中。所有阳性样品，发出 检测报告30d后方可无害化处理。 5.2.2样品应放在不透水、防泄漏的密封袋中，置于保温盒中，并加冰袋或冰块保持低温，尽快送到实验 室。所有样品应附有一份说明，内容包括样品提交人、样品采集地点（最好标明经度和纬度）、采样日期、联 系方式、动物种类、动物年龄（日龄）、动物部位、动物病史等。 1 NY/T 4031—2021 6检测方法 6.1压片镜检法 6.1.1主要仪器设备 6.1.1.1外科手术剪。 6.1.1.2不锈钢镊子。 6.1.1.3不锈钢、铝合金或塑料肉样盘，内有格子并编号。 6.1.1.4载玻片。 6.1.1.5普通生物显微镜或倒置显微镜。 6.1.2试剂 6.1.2.1甘油（生化级）：市售产品。 6.1.2.2甘油透明液（见附录A中的A.1)。 6.1.3操作方法 6.1.3.1目检 剔除肉样上附着的脂肪组织、结缔组织，撕去肌膜，暴露出肌肉表面层后，在阳光下或日光灯下仔细观 察肌肉内、肌肉表面是否含有纺锤形、圆柱形、卵圆形、椭圆形、长形等形状，与肌纤维方向平行的灰白色或 乳白色包囊。 6.1.3.2压片镜检 取目检时剪取的包囊、疑似包囊，直接用2片载玻片压片镜检。目检未见包囊的肉样，按随机采样的 要求，用剪刀顺肌纤维方向剪取肉样，再沿肌纤维方向剪成铅笔芯大小的小条（约10mm×3mm× 3mm），每个部位至少4条。将剪取的肌肉放在载玻片上，每片放置4条6条。必要时，可添加适量甘 油透明液。另取一块载玻片重叠放在有肉条的载玻片上，用力挤压，使肉条压成半透明（能初步看清另一 块载玻片下面背景的字样）。把制好的压片放在低倍显微镜下（10倍×10倍），从压片一端的边沿开始检 查，直到另一端为止。 6.1.4结果判定 6.1.4.1不同种类的住肉孢子虫包囊大小、形态差异很大，部分种类肉眼可辨，如山羊的莫尔氏住肉孢子 虫（Sarcocystismoulei）和绵羊的巨住肉孢子虫（S.gigantea）的包囊。莫尔氏住肉孢子虫包囊呈暗白 色、卵圆形，长可达17mm，宽可达7mm，常见于食道；包囊内壁分枝，呈菜花状，包含13um～15μm长 的缓殖子；有时可见2种大小的包囊：一种末端粗而圆，缓殖子大小为（11～17)μm（平均14.1μm）×（3～ 6)μm（平均4.5μm），仅在食道肌肉中出现，另一种为薄壁包囊，小而细，所含缓殖子大小为（9～13)μm （平均12.2μm)×（2~4)μm（平均2.9μm），可见于隔肌和骨骼肌中。肉眼可见的巨住肉孢子虫包囊主 要存在于年龄较大的老羊，食道、喉和舌头常见，横隔膜和体的其他部位较少出现，其包囊长度可达 1cm，呈暗白色，圆形、椭圆形或梨形，有时类似米粒。包囊壁薄（<2μm）、光滑，常被结缔组织包围。但 多数家畜、家禽寄生的住肉孢子虫种类的包囊肉眼难以觉察，如猪的住肉孢子虫包囊长仅2mm或更小。 因此，目检法若直接在肌肉内发现住肉孢子虫大型包囊，可判为疑似，继续进行显微镜观察；未发现住肉孢 子虫大型包囊，按显微镜观察结果判定。 6.1.4.2在显微镜下，若发现住肉孢子虫包囊，呈纺锤形、圆柱形、卵圆形、椭圆形、长形等形状，包囊壁光 滑或表面有横纹、短指状突起，压迫包囊溢出有大量直径10μm～20μm，呈圆形、椭圆形或香蕉形、颜色 偏暗的缓殖子（如果虫体已经钙化，则呈黑色小团块)（见附录B），即可确定为住肉孢子虫感染。一份肌肉 样品任一部位发现有住肉孢子虫包囊，即可判定该份肉样为住肉孢子虫阳性；若各部位肌肉均未发现住肉 孢子虫包囊，则判定为阴性。 6.2PCR法 6.2.1仪器 2 NY/T4031—2021 6.2.1.1PCR基因扩增仪。 6.2. 1. 2 高速台式冷冻离心机：最大转速大于15000r/min， 6.2.1.3 低速大容量离心机：最大转速大于3000r/min。 6. 2. 1. 4 微量可调移液器：2μL、10μL、20μL、200μL、1000μL。 6.2. 1.5 核酸电泳仪。 6. 2. 1. 6 核酸电泳槽。 6. 2. 1.7 凝胶成像分析系统。 6. 2.1. 8 组织研磨仪。 6.2.1. 9 高压蒸汽灭菌器。 6.2.1.10 水浴锅。 6.2.2材料 6.2.2.1外科手术剪 6. 2. 2. 2 不锈钢镜 Q 6.2.2.3烧杯： 6.2.2.4离心 6.2.2.5200 CRC 6.2.2. 6 陶 瓷珠 或不锈钧 6.2.3试剂 A 6.2.3.1 缓 6.2.3.2 1 E贝 6.2.3.3 10 6.2.3.4 织基因 6.2.3.5 水 级水的规格。 6.2.3.6 DNA 6.2.3.7 10XP CDT 6.2.3. 8 2.5mm 6. 2.3. 9 引物（上、 见附录C)。 6.2.3. 10 2000bpDN 子质量 6.2.3. 11 琼脂糖（电泳级） 6. 2. 3. 12 DNA上样缓冲液：市售 6.2.3. 13 蛋白酶K：市售产品。 6.2.3.14质控标准包囊：阳性质控标准住肉孢子虫包囊为隆美尔住肉孢子虫、德宏住肉孢子虫、家山羊 犬住肉孢子虫、米氏住肉孢子虫、柏氏住肉孢子虫或其他种类的住肉孢子虫包囊，肉眼可见的大型包囊数 量在10个以上，肉眼无法分辨的包囊在10个以上。阴性质控对照为不含住肉孢子虫包囊的同种类 肌肉。 6.2.4操作步骤 6.2.4.1DNA抽提 取出新鲜或冻存肌肉，除去脂肪和结缔组织，按采集的样品体积大小，进行多点取样（至少3个点），每 个点取0.1g左右。将所取样品混合在一起，用灭菌的剪刀将肌肉剪碎，置于无菌1.5mL离心管中，加人 2颗～3颗陶瓷珠或不锈钢珠，用组织研磨仪研磨。研磨好的样品加入400μLPBS和40uL蛋白酶K，充 分混勾后，放置于56℃水浴锅消化2h～3h至溶液澄清，其间每30min混匀1次。消化完成的肌肉悬浮 3 NY/T4031—2021 液，按DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。测定并记录DNA在260nm和280nm的吸光度，将 DNA适当稀释或浓缩，使其OD260值在0.1～0.8的区间内。以1个OD260值相当于50mg/LDNA浓度 来计算DNA的浓度;DNA溶液OD260/OD28值应为1.72.0，或质量能符合检测要求。将提取的基因组 DNA置于一20℃冰箱保存。 6.2.4.2PCR扩增 采用PCR方法扩增住肉孢子虫co1基因部分序列,PCR产物大小约为1085bp。PCR采用50μL 反应体系： 10XPCRBuffer(含MgCl2) 5.0 μL dNTPMixture(2.5mmol/L) 4. 0 μL SF1(100 μmol/L) 1. 0 μL SR9(100 μmol/L) 1. 0 μL DNA聚合酶(1.0U/μuL） 1. 0 μL DNA模板 0. 1 μg~1. 0 μg