SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1942.2—2007 进出口动物源性食品中布鲁氏菌属 检验方法 第2部分：PCR检验方法 Detection of Brucella in food from animal for import and export- Part 2:PCR method 行业标准信息服务平台 2007-08-06发布 2008-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1942.2—2007 前言 SN/T1942一2007《进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法》分为两部分： 第1部分：分离与计数方法； 一第2部分：PCR检验方法。 本部分为SN/T1942的第2部分。 本部分的附录A和附录B均为规范性附录。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局，中华人民共和国黑龙江出人境检验检 疫局。 本部分主要起草人：吴斌、郑秋月、贾赞、李苏龙、李振荣、胡传伟。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T1942.2—2007 进出口动物源性食品中布鲁氏菌属 检验方法 第2部分：PCR检验方法 1范围 SN/T1942的本部分规定了进出口动物源性食品中布鲁氏菌属PCR检验方法。 本部分适用于进出口动物源性食品中布鲁氏菌属的快速检验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T1942的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1942.1进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法第1部分：分离与计数方法 WS/T230—2002临床诊断中聚合酶反应技术的应用 3生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测布鲁氏菌，所有培养物和废弃物应小心 处置。并按照GB19489中的有关规定进行。 4防污染措施 参照WS/T2302002中第6章进行污染的预防和控制。 5术语、定义和缩略语 5.1术语和定义 5. 1. 1 布鲁氏菌属 Brucella 布鲁氏菌属为一类革兰氏阴性短小球杆菌，可分解葡萄糖等糖类，产酸量少，无动力，无芽胞，过氧 化氢酶阳性。 5. 1. 2 聚合酶链反应polymerasechainreaction，PCR 使用两段（通常长度为15个～25个核苷酸）寡脱氧核苷酸作为反应的引物，这两段引物序列应不 发生互补作用，可以和作为模板的待测DNA两条链上的特定位点分别发生互补。反应液包括含有镁 离子的反应缓冲液、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、模板DNA引物及热稳定DNA聚合酶组成。在 DNA聚合酶催化下，通过DNA变性、退火及延伸数十个循环的反复变化而获得两个互补位点之间 DNA片段的大量拷贝。 1 SN/T 1942.2—2007 5. 1. 3 引物primer 应用化学方法合成一对与已知待扩增基因片段两侧DNA序列互补的寡核苷酸，作为PCR扩增的 引物。 5.2缩略语 下列缩略语适用于SN/T1942的本部分。 5.2.1PCR:polymerasechainreaction(PCR），聚合酶链反应。 5.2.2DNA：deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。 5.2.3dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷三磷酸。 5.2.4dATP：deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸。 5.2.5dCTP：deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸。 5. 2. 6 dGTP：deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。 5.2.7 dTTP：deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸。 5.2.8dUTP：deoxyuridinetriphosphate，脱氧尿苷三磷酸 5.2.9UDG：uracilDNAglycosylase,尿嘧啶DNA-糖基酶。 5. 2. 10 0bp:basepair,碱基对。 5.2. 11 Taq：Thermusaquaticu，水生栖热菌。 5.2. 12 2Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。 5.2.13 TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液。 6培养基和试剂 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。 6.1布鲁氏菌肉汤培养基（见第A.1章）。 6.2 布氏琼脂（见第A.2章）。 6.3肝浸液培养基（见第A.3章）。 6.4 胰蛋白陈培养基（见第A.4章）。 6.5布鲁氏菌属检验用引物： 5'-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3 5'-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3' 预计扩增目的片段223bp。 6.6TaqDNA聚合酶 6.7dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。 CMCC55008，猪布鲁氏菌CMCC55006，绵羊布鲁氏菌CMCC55305，犬布鲁氏菌CMCC55307，森林鼠 布鲁氏菌CMCC55224。大肠杆菌质控菌株：CMCC25922。 6.9琼脂糖。 6.10溴化乙锭。 6.11DNA分子量标记：100bpDNAladder。 6.12细菌基因组DNA提取试剂盒。 6.13 3TE缓冲液:10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)。 6.14 10XPCR缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 4)、200 mmol/L KCl、15 mmol/L MgCl2。 6.15 5TAE电泳缓冲液（储备液X50）：Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/LEDTA（pH8.0） 100mL，用蒸馏水定容至1000mL，混匀，室温保存。使用时取20mL50XTAE电泳缓冲液，稀释为 2