ICS11.220 CCSB41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4027—2021 【群禽腺病毒检测方法 Diagnostic methods for group I fowl adeonvirus 2021-12-15发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 4027—2021 业欢园 目 次 前言 引言 范围· 规范性引用文件 3 术语和定义 缩略语. 临床诊断 5. 1 流行病学 5. 2 临床症状 5. 3 病理变化 5. 4 结果判定 6PCR检测 6. 1 仪器设备和耗材 6.2 试剂 6.3操作方法 6.4结果判定 7荧光PCR检测 7.1 仪器设备和耗材 7. 2 试剂· 7.3 操作方法 7. 4 结果判定 8IFA鉴定 8.1 仪器设备和耗材 8.2 试剂.. 8. 3 操作方法 8.4 结果判定 9病毒分离培养 9.1 仪器设备和耗材 9.2 试剂. 9.3 细胞和鸡胚 9.4 操作方法 9.5 结果判定 10综合判定 附录A（资料性） 溶液配制： 附录B(资料性) PCR检测引物及判定标准图例 附录C(资料性) 阳性对照病毒… 附录D(资料性) 荧光PCR检测引物及判定标准图例 附录E(资料性) IFA鉴定使用单克隆抗体及判定标准图例 11 附录F(规范性) 细胞培养 12 1 NY/T 4027—2021 全国农业食品标准 典通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本文件起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、山东农业大学、中国兽医药品监察所。 本文件主要起草人：潘青、王笑梅、高玉龙、唐熠、李俊平、崔红玉、刘长军、刘爱晶、祁小乐、张艳萍、李 凯、高立。 II NY/T 4027—2021 引言 I群禽腺病毒（groupIfowladenovirus,FAdV-I）是危害家禽养殖业的重要传染病病原，主要感染 鸡、鸭、鹅等家禽，给我国家禽养殖业造成了巨大的经济损失。FAdV-I属于腺病毒科禽腺病毒属，可分为 5个种(A～E)和12个血清型(1～7,8a～8b,9～11),不同血清型FAdV-I感染家禽症状不尽相同，致病 毒株感染鸡可引起包涵体肝炎（inclusionbodyhepatitis，IBH）、心包积液-肝炎综合征（hydropericardium- hepatitissyndrome，HHS)等病变，非致病毒株感染无典型临床症状和病理变化。我国FAdV-I主要流 行血清型为FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11,且致病血清型在不断增多，尤其2015年以来，我国 突发流行的新型FAdV-4感染鸡引起的HHS,死亡率可达30%～100%，给养禽业带来严重的经济损失， 然而，目前尚没有FAdV-I标准化的检测方法。基于此，特制定本文件。 本文件规定了FAdV-I的临床诊断、PCR检测、荧光PCR检测、IFA鉴定和病毒分离培养方法，适用 于我国家禽FAdV-I检测的需求。 NY/T4027—2021 I群禽腺病毒检测方法 1范围 本文件规定了I群禽腺病毒检测的临床诊断、病毒核酸检测(PCR和荧光PCR)、病毒Hexon蛋白检 测（IFA)、病毒分离培养的技术要求和规范。 本文件适用于I群禽腺病毒检测 2规范性引用文件 下列文件中的内容通 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于 文件，只注 包括所有的修改单）适用本文件。 GB/T 6682 析实 GB19489 验 生物安全 NY/T541 兽医 输技术规 NY/T194 S 3术语和定义 本文件没有 需要界定 UR 4缩略语 下列缩略 CEL:鸡 代肝细 DNA:脱 糖杉酸 OXY EB:溴化 (Fthidrun FAdV:禽腺 青(Fo) FAdV-I: FAdV-1:血清 盆腺病 FAdV-4：血清 FBS：胎牛血清(Fe FITC:异硫氰酸荧光 uoresce Ocva HHS：心包积液-肝炎综合 atitissyn HPS：心包积液综合征（Hydropericar umsyndrome) IBH：包涵体肝炎（Inclusion-bodyhepatitis） IFA：间接免疫荧光（Indirectimmunofluorescenceassay） LMH：鸡肝癌细胞系(Leghornmalehepatocellularcells) PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered salinebuffer) PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction） 5临床诊断 5.1流行病学 鸡、鸭、鹅等家禽对FAdV-I易感，野鸡、火鸡、鸽、驼鸟等野鸟也可感染。FAdV-I主要通过呼吸道 染3周龄～7周龄肉鸡、蛋鸡，大日龄也可感染，感染后3d～4d出现死亡高峰，死亡率可达30%～100%。 1 NY/T4027—2021 非致病毒株呈隐性感染，无典型临床症状和病理变化。 5.2临床症状 FAdV-I致病毒株感染通常会出现精神沉郁，羽毛松乱，采食量下降，体重下降，排泄物呈黄色黏液状 等临床症状。 5.3病理变化 FAdV-I致病毒株感染通常表现为肝脏肿大，边缘钝圆，表面有不同程度的出血点，部分血清型致病 毒株可导致心包积液，肝细胞变性坏死，出现核内包涵体。 5.4结果判定 符合上述5.1、5.2、5.3基本特征的病例，可判定为FAdV-I感染疑似病例。 6PCR检测 6.1仪器设备和耗材 6.1.1PCR扩增仪。 6.1.2台式低温高速离心机。 6.1.3稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。 6.1.4凝胶成像仪（或紫外透射仪)。 6.1.5-20℃冰箱。 6.1.7手动或电动移液装置。 6.1.86孔细胞培养板， 6.1.9吸头。 6.1.10PCR扩增管。 6.1.111.5mL离心管。 6.2试剂 6.2.1PBS,见附录A中的A.1。 6.2.2组织研磨液，见附录A.2。 6.2. 3 3商品化DNA提取试剂盒。 6.2.4商品化PCR反应试剂盒。 6.2.5引物FAdV-IF和FAdV-IR,见附录B中的B.1。 6.2.6TAE缓冲液，见附录A.3。 6.2.7琼脂糖凝胶，见附录A.4。 6.2.8灭菌双蒸水（ddH2O)。 6.3操作方法 6.3.1样品准备 取待检肝组织样品1.0g～2.0g，按照1：5（W/V)比例加入组织研磨液，制成混悬液，冻融3次。 4℃12000r/min离心15min，取上清液，0.22um滤器过滤，备用。 阴性对照样品为未接毒的LMH细胞或CEL细胞培养液，阳性对照样品为HLJFAd15（见附录C)或 其他背景清楚的FAdV-I毒株病毒，待检样品为疑似病例肝组织悬液上清或培养病毒样品。 6.3.2DNA提取 6.3.3PCR反应 见表1。 NY/T4027—2021 表1PCR反应体系(25.0μL) 试剂 体积，μL 2XExTagpremix 12.5 FAdV-I F(10 μmol/L) 1. 0 FAdV-I R(10 μmol/L) 1. 0 DNA模板 2. 0 ddH,O 8.5 将PCR扩增管放入PCR扩增仪进行扩增。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退 火30s，72℃延伸105s，35个循环；72℃延伸 反应结束 6.3.4凝胶电泳 取PCR产物5μL加入 琼脂糖 F缓冲液中进行160V恒压电泳，15min~ 20min，在凝胶成像系统中观察结果 6.4结果判定 6.4.1成立条件 阴性对照样品 没有 增出任 则试 式验成立（判定标准图 例见B.3)。 6.4.2结果判定 在试验成 立的 检样品 FA d-I核酸阳性。 如需确定病毒的 清型/可 待检样品 品无 寺异证条 主判定待检法 R 7 荧光PCR检测 7.1仪器设备和 耗材 7.1.1荧光定量 PCR 7.1.2 微量市 0μ各1支）。 7.1.3 吸头。 7.1.4 荧光POR 7.2试剂 7.2. 1 商品化荧光 7.2. 2 引物FAV-F和 AV-R，见除 的 7.2.3 标准品质粒见D. 7.2.4灭菌双蒸水(ddH2O) 7.3操作方法 7.3.1样品准备 样品准备与DNA提取见6.3.1。 7.3.2PCR反应 见表2。 表2荧光PCR反应体系(20.0μL) 试剂 体系，μL 2XSYBR qPCRMix 10. 0 FAV-F(10 μmol/L) 1. 0 FAV-R(10 μmol/L) 1. 0 DNA模板 2. 0 O"HPP 6. 0 3