ICS65.020.01 CCSB21 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4021—2021 小麦品种真实性鉴定 SNP标记法 Wheat (Triticum aestivum L.) variety genuineness identification- SNPbased method 2021-12-15发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T4021—2021 前平言 公共服务 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部种业管理司提出。 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本文件起草单位：北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心、全国农业技术推广服务中心、 北京作物学会、山东省农业科学院作物研究所、中国农业科学院作物科学研究所、黑龙江省农业科学院农 产品质量安全研究所。 本文件主要起草人：庞斌双、任雪贞、刘丽华、赵昌平、张明明、金石桥、李宏博、刘阳娜、周泽宇、张风 廷、张立平、张胜全、马锦绣、权威、王穆穆、张旭、侯建、关海涛、傅友兰、王卫红。 I NY/T4021—2021 小麦品种真实性鉴定 SNP标记法 1范围 本文件规定了利用SNP标记法进行小麦（TriticumaestiumL.）品种真实性鉴定的术语和定义、缩 略语、原理和总则、试验条件、试剂和材料、仪器设备、样品、检测程序、结果计算与表示和结果报告。 本文件适用于小麦品种的真实性验证、真实性身份鉴定， 活用于品种关系鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过 其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本运 适用于 （包括 所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T3543.2 中 GB/T6682 格租 术语和定义 S 下列术语和定义运 适用于 3. 1 A 单核苷酸多 Gngl nucleotide polymorphism 在基因组水 单个核千酸变异所引起的DNA序列多态性 3. 2 品种真实性验证 -varietyverifieation 与其对应品种 称的标准样品比较，检测证实送验样品与 香相符； 重用手标准样品的 情况下，可用对照样 进行比 3. 3 R 品种真实性身份鉴 Sidentification 通过与标准样品D 指纹数据 3. 4 标准样品 standard sampl 国家指定机构保存的具有法 身份的代表品种特征特 实物种子 NA样品。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide）。 DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)。 KASP：竞争性等位基因特异性PCR（kompetitiveallelespecificPCR）。 PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。 SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate)。 5原理和总则 5.1原理 小麦不同品种的基因组，存在着能够世代稳定遗传的单核苷酸多态性（SNP)差异。利用SNP差异， 1 NY/T4021—2021 通过与标准样品DNA指纹数据比对或筛查的方式，进行品种真实性验证和品种真实性身份鉴定 5.2总则 5.2.1应依据“适于检测目的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的检测平台、引物或探 针、样品数量，经过验证，制订相应的检测方案；品种真实性验证依据SNP位点差异数目进行判定，品种真 实性身份鉴定依据SNP位点相似度进行判定。品种关系鉴定可采用品种真实性身份鉴定的检测方案。 5.2.2本文件避选了96个SNP位点用于品种真实性验证，引物信息、等位变异、参照样品信息及位点信 息详见附录A。50000个SNP位点用于品种真实性身份鉴定，位点信息详见种业大数据平台。品种真实 性验证允许采用序贯方式检测，若检测到可排除两者为同一品种的差异位点数的，可终止检测。 5.2.3本文件推荐了基于KASP技术的荧光原位扫描平台和基于激光微刻SNP芯片分型2个检测 平台。 6试验条件 真实性鉴定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行，包括但不限于下列条件： 种子检验人员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能； 所有仪器与使用的技术相适应，并已经过定期维护、验证和校准； 使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材； 使用校准检测结果评定的适宜参照样品。 7试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。 7.1DNA提取 7.1.1CTAB[C1H33(CH3);NBr,CAS号:57-09-0]。 7. 1. 2 2三氯甲烷（CHCl3，CAS号：67-66-3）。 7.1.3异戊醇(CsH2O,CAS号：123-51-3)。 7.1.4异丙醇（CHgO,CAS号：67-63-0)。 7.1.5 乙二胺四乙酸二钠（CloHuN2NazOs，CAS号：139-33-3)。 7. 1. 6 三羟甲基氨基甲烷[NH,C(CH2OH)3，CAS号：77-86-1]。 7.1.7 氢氧化钠（NaOH,CAS号：1310-73-2）。 7. 1. 8 氯化钠（NaCI,CAS号：7647-14-5）。 7. 1. 9 无水乙醇（CHCH2OH,CAS号：64-17-5）。 7. 1. 10 盐酸（HCI,CAS号：7647-01-0)。 7. 1. 11 β-基乙醇（C2HOS,CAS号：60-24-2）。 7. 1. 12 醋酸钠（C,H.NaO2，CAS号：127-09-3）。 7. 1. 13 3醋酸钾（CHKO2，CAS号：127-08-2)。 7. 1.14 SDS(C12H25NaSO，CAS号：151-21-3)。 7. 1. 15 5RNaseA(CAS号：9001-99-4)。 7.2SNP基因分型 7.2.12XPCR MIX。 7.2.2引物混合液。 7.2.3定制芯片及配套试剂。 8仪器设备 8.1高速冷冻离心机：转速≥12000r/min。 2 NY/T 4021—2021 8.2微量移液工作站或微量移液器。 8.3水浴锅或干式恒温金属浴：20℃~100℃。 8.4紫外分光光度计：波长定点扫描230nm、260nm和280nm。 8.5组织研磨仪 8.6分析天平：感量为0.01g。 8.7 pH计。 8.8涡旋混合器。 8.9 高压灭菌锅。 8.10 PCR扩增仪或水浴PCR扩增装 8. 11 荧光原位扫描系统：3色及 以上荧光 PUBLI 8. 12 烘箱：20℃~100℃ 8. 13 芯片扫描仪及其配 相关 8. 14 杂交箱：20℃ 8. 15 板式离心机：4 500 8. 16 摇床。 9 样品 9.1 送验样品可 子幼 叶德 组织或器宜 要打的样品数量 3543.2的规 定。送验样品如 应不低于50g或不少于1 粒为幼苗叶片 成器官，样品 应至少来自30 9.2试验样品 少含有 混合检测或单 10检测程序 U 10.1引物/探针 根据真实性验 圣相应的引 或 创进行 10.2DNA提取 10.2.1DNA质量要 DNA提取方法应保证提反的 DOA 择解，溶液的紫外光 吸光度OD260与OD280的比值 宜介于 提取可任选10.2 、10. 其他能够满足要求的 方法。 10.2.2CTAB法 从试样中随机取30个以上的胚、胚芽 幼苗或叶片200mg~3 置于2.0mL离心管中加液氮充 匀。每管加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，充分混合后静置10min，4℃、10000r/min离心10min。吸 4℃、10000r/min离心10min，弃上清液，加入70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥，加人200μL ddH2O充分溶解，检测浓度备用。溶液配置见附录B。 10.2.3高盐法 从试样中取30粒以上的种子研磨成粉末，从中取100mg小麦粉于1.5mL离心管中，加入700μL DNA提取液（室温低于20℃时须65℃预热）充分混勾，置于65℃孵育30min，其间轻微颠倒混匀；每 管加入DNA提取液1/3体积的2.5mol/L醋酸钾工作液充分混勾，室温静置10min，4℃、10000r/min 离心，取上清液于新的1.5mL离心管中；向上清液中加人0.7倍体积的异丙醇（7.1.4)颠倒混匀，室温静 置5min，4℃、10000r/min离心10min；弃上清液，加人70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥，加人 3 NY/T4021—2021 200μLddHzO充分溶解，检测浓度备用。溶液配置见附录B。 10.3SNP基因分型 10.3.1荧光原位扫描检测 10.3.1.1PCR扩增 PCR反应可以在不同规格的PCR板或膜上进行，反应体系的总体积和各组分体积按照表1进行配 制，每板设空白对照，试验过程中设2个参照样品。 表1基于微孔板或微量反应孔膜平台的PCR反应体系 单位为微升 微孔板类型 96微孔板 384微孔板 1536微孔板 微量反应孔膜 DNA模板（30ng/μL) 1. 5 1.5(烘干） 1.5(烘干) 1.6(烘干） 2XPCRMIX 5 1.5 0. 5 0.8 引物混合液（B.2） 0.140 0.042 0.014 0.024 双蒸水 3.36 1. 5 0. 5 0. 776 总反应体积 10 3 1 1. 6 PCR扩增反应程序如下： a)94℃15