ICS65.020.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3693-2020 百合菱病抗性鉴定技术规程 Technical code of practice for identification of lily resistance to fusarium wilt 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3693—2020 合前标 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理提出并归口。 本标准起草单位：云南省农业科学院花卉研究所、国家观赏园艺工程技术研究中心、农业农村部花卉 产品质量监督检验测试中心（昆明）、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心、云南省 花卉标准化技术委员会、昆明市花卉遗传改良重点实验室、云南云科花卉有限公司。 本标准主要起草人：张艺萍、杨秀梅、瞿素萍、王继华、王丽花、张丽芳、苏艳、许凤、周旭红、邹凌、赵阿 香、马璐琳。 I NY/T3693—2020 百合枯萎菱病抗性鉴定技术规程 1范围 本标准规定了百合枯萎病抗性鉴定的试剂与耗材、仪器设备、枯萎病菌接种体制备、室内抗性鉴定、病 情调查、抗病性评价和鉴定材料处理。 本标准适用于百合（Liliumspp.）种质资源对百合枯萎病抗性的室内鉴定与抗性评价。 2规范性引用文件 NY/T1857.3 枯萎病鉴定技术规程 3试剂与耗材 A 3.1马铃薯蔗糖培养液(PS 800 布过滤，补加蒸馏水至 1000mL，加人蔗糖20/g溶化后于21 3.2马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA 在制作！ 培养液的基础上加20g琼脂 FC高压 3.31%或2%自 的次氯酸钠（NaCIO)溶液 取1ml 或 灭菌水口 3.4耗材 培养皿、锥形 4仪器设备 Y 恒温摇床、恒温培养箱、冰条 净工 显微镜、移液器 板等 5枯萎病菌接种体制备 5.1病原物分离 5.1.1病样采集 参照附录A，田间采集具有典型枯萎病症状的百合植株和种球样品，放人封口袋密封，登记编号后放 入4℃冰箱保存备用。 5.1.2病样处理 取病株病健组织交界部位，用解剖刀切成1cm长的茎段，或取百合带病种球，于病健组织交界部位切取 小块鳞茎（0.5cm×0.5cm），自来水清洗干净后用75%酒精浸2s3s，再用2%次氯酸钠溶液浸泡3min， 取出用灭菌水清洗3次。 5.1.3病原分离 在超净工作台内，将消毒好的茎段或小块鳞茎接种至PSA平板培养基，每培养皿接3块～4块，写明 编号后用保鲜膜封好，放至（25土2)℃培养箱中培养5d～7d。 5.1.4分离物鉴定及纯化 分离物鉴定参见附录A。确认为尖孢镰刀菌百合专化型（Fusariumoaysporumf.sp.Lilii）后，采用 单孢分离法进行分离物纯化，经科赫（Koch)法则验证后，将经过纯化的百合枯萎病致病菌接种于PSA斜 1 NY/T 3693—2020 面培养基上，在（25土2)℃的恒温培养箱中培养7d，置于4℃～8℃冰箱内保存备用。 5.2接种体繁殖和保存 5.2.1接种体的繁殖 将保存的百合枯萎病菌置于25℃PSA平板培养基上培养3d活化后，接种于盛有PS培养液的锥形 瓶中，置于（25士2）℃摇床上，以120r/min振荡培养3d～5d。将培养液经两层医用纱布过滤即得以小 型孢子为主的孢子悬浮液，然后用蒸馏水稀释滤液至所需接种浓度， 5.2.2接种体保存 常用保存方法为将百合枯萎病菌接种于PSA斜面培养基上，在（25土2)℃的恒温培养箱中培养7d， 置于4℃～8℃冰箱内保存。 6室内抗性鉴定 6.1 鉴定室 人工接种鉴定室应具备人工调节温度、湿度及光照的条件，使人工接种后具备良好的发病环境。 6.2鉴定设计 鉴定材料随机排列或顺序排列，每份鉴定材料重复3次，每一次重复10株苗或是20片鳞片。 6.3鉴定对照材料 设高抗百合品种为抗病对照品种，高感百合品种为感病对照品种，同时设置空白对照。 6.4鉴定材料准备 6.4.1采用百合组培生根苗。将百合组培生根苗移栽至穴盘中炼苗，炼苗基质为泥炭：珍珠岩=2：1 （体积比），经高温蒸汽灭菌（134℃，30min）。在温室或塑料大棚内炼苗，设施内温度白天为20℃～26℃， 夜晚为15℃～20℃。所有幼苗应生长健壮、一致，每株幼苗有8片以上展开叶。 6.4.2采用百合种球鳞片。将不同系列正常可开花的百合种球由基部小心剥离，去除外层鳞片，将中层 鳞片置于1%NaClO溶液中消毒10min，在自来水下冲洗干净后置于滤纸上晾干待用。 6.5接种 6.5.1接种时期 缓苗后正常生长的幼苗和消毒晾干后的鳞片。 6.5.2接种浓度 接种体悬浮液的分生孢子数为（1～1.5）×10°个/mL。 6.5.3接种方法 6.5.3.1百合组培生根苗采用灌根接种法。用灭菌注射器吸取接种体悬浮液注射至百合植株茎基部，每 株注射2mL。接种后用塑料薄膜覆盖植株，保湿48h。 6.5.3.2百合（种球)鳞片采用土壤接种法。用接种针挑取小块保存的接种体菌丝接种于马铃薯蔗糖琼 脂培养基（PSA）上，待菌丝长满平板后用打孔器切取5块直径为8mm的菌块，接种至灭菌的100mL燕 麦一基质泥炭混合物中，燕麦：泥炭=1：5（W/W）。（25士2)℃培养14d后，将菌土混合物充分压碎，按 1%（V/V)的比例加人灭菌基质泥炭中，混勾，（25土2）℃培养14d，使菌落稳定后，将百合鳞片包埋于含有 菌土的基质中；或将鳞片扦插到基质中，注意基部朝下，插人深度为鳞片的1/2,间距3cm。 6.5.3.3空白对照是采用无菌水代替孢子悬浮液进行接种。 6.5.4接种后管理 6.5.4.1接种后将植株置于鉴定室内，每天光照14h，强度为70μEm-²s，保持植株正常生长的土壤湿 度，即60%～70%，接种期间鉴定室温度控制在（25土2)℃范围内。 6.5.4.2将接种百合鳞片的花盆置于鉴定室内，60%～70%相对湿度，18℃条件下培养。 7病情调查 7. 1 调查时间 2 NY/T3693—2020 百合组培生根苗接种后10d15d调查病情，百合鳞片则是60d后调查病情，根据此期间感病对照 品种病级扩展到感病病级的时间，可将调查病情的时间作适当调整。 7.2病情级别划分 幼苗和鳞片病情级别及相应的症状描述见表1和表2。 表1百合组培苗枯萎病病情级别的划分 病情级别 症状描述 0 无症状 1 叶片叶缘卷曲黄化、萎，受害面积占植株面积25% 2 叶片卷曲黄化、萎，受害面积占植株面积26%~50% 3 叶片卷曲黄化、萎，受害面积占植株面积51%～75% 4 叶片全部萎或死亡，受害面积占植株面积76%～100% 表2百合鳞片枯萎病病情级别的划分 病情级别 症状描述 0 无症状 1 轻微腐烂，腐烂面积占单片鳞片25% 2 中度腐烂，腐烂面积占单片鳞片26%~50% 3 严重腐烂，腐烂面积占单片鳞片56%～75% 4 极严重腐烂，腐烂面积占单片鳞片76%~100% 7.3调查方法 按7.2病情级别划分调查每份鉴定材料发病情况，根据病害症状描述，逐份材料进行，记载单株/单片 鳞片病情级别。 7.4病情指数统计方法 计算每份鉴定材料的病情指数（DI)，计算结果取3次重复平均值。 病情指数(DI)按式(1)计算。 Z(sXn) DI= X 100 (1) NXS 式中： DI 病情指数； 各病情级别的代表数值； u 各病情级别的植株数/鳞片数； N 调查总植株数/鳞片数； S 最高病情级别的代表数值。 8抗病性评价 8.1鉴定有效性判别 8.1.1当感病对照材料达到其相应感病程度(DI≥50），抗病对照材料与实际抗性程度相符，该批次抗枯 萎病鉴定视为有效。 8.1.2以对照品种发病程度明显异常时判定该批次鉴定无效。 8.2抗病性评价标准 依据鉴定材料的病情指数（DI)平均值确定其抗性水平，划分标准见表3。 NY/T3693—2020 表3百合枯萎病抗性评价标准 病情指数(DI) 抗性评价(级别) DI=0 免疫Immune（I) 0<DI<15 高抗Highlyresistant(HR) 16≤DI<50 中抗Moderatelyresistant(MR) 51≤DI<75 中感Moderatelysusceptible(MS) 76≤DI≤100 高感Highlysusceptible(HS) 8.3鉴定结果 根据8.1与8.2将不同病情级别的株数/鳞片数、病情指娄 3个重复的平均病情指数、抗性评价（抗 感水平)等鉴定结果填入附录B 9 鉴定材料处理 采用蒸汽高温消毒处理，温度达 到134℃以上并保持 NY/T 3693—2020 附录A (资料性附录） 百合枯萎病病原菌 A.1百合枯萎病症状 百合枯萎病发生时，尖孢镰刀菌从百合的根部或种球基盘的伤口侵人，引起百合肉质根和种球基盘褐 化、腐烂，并逐渐向上扩展。鳞片上的病斑呈褐色并凹陷，而后变成黄褐色并逐渐腐烂。后期鳞片从基盘 散开而剥落。感染尖孢镰刀菌百合枯萎病的种球长出的植株明显变矮，受害叶片呈牛皮纸样，植株上的叶 片由上而下黄化或变紫，茎秆自下而上逐渐枯萎，最后整个植株枯萎而死。病株茎秆的维管束变褐。发病 严重的则茎基部缢缩易折断。在百合种球储存及运输的过程中，该病还会持续危害，引起鳞茎腐烂。在湿 度大的时候，可在发病部位看到粉红色或粉白色的霉层。 A.2病原特征及病害传播途径 百合枯萎病是由尖孢镰刀菌百合专化型（图A.1、图A.2)侵染引起的一种土传病害。该菌属半知菌 孢细胞单瓶梗，且短。培养物牵牛紫色。小型分生孢子为卵圆 形，数量较多，其