ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3691—2020 粮油作物产品中黄曲霉鉴定技术规程 Technical code of practice for identification of Aspergillus flavus in grain and oil crops 2020-08-26 发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3691—2020 前 言 国农 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室 （武汉）、农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：张奇、岳晓凤、白艺珍、印南日、喻理、马飞、李培武。 I NY/T 3691—2020 粮油作物产品中黄曲霉鉴定技术规程 1范围 本标准规定了粮油作物中黄曲霉分离培养、形态鉴定及分子生物学鉴定方法。 本标准适用于稻谷、小麦、玉米、花生等粮油作物产品中黄曲霉鉴定与调查。 2规范性引用文件 凡是不注日期的引用文件 其最新版本色括所有的修改单适甲体 NI GB4789.1 食品 同家标微食 微生物 GB4789.15 全国家标准 微生物 GB 4789.16 食品 安全国家标准 食品微生物学检验 鉴定 GB/T 6682 实脸至用水规格利式验 GB 19489 安全通用零 GB/T 274 实验室 硅控制规范 3术语和缩略语 A 3.1黄曲霉( lusf 属真菌 cota)，盘菌亚 门(Pezizomyco 散装 纲（Eurotiomycet (Eurotiales), 发菌科（Tricho 3.2AFPA:A avusan parasiticu. 基础培 3.3BLAST:B loca gn 基丁局部比对算法的 3.4β-tubulin:β 3.5Calmodulin：钙 3.6CTAB:十六烷基 金溴化 3.7 DG18:Dichloran G rol Agar 氯硝胶 油培养基 3.8DNA:Deoxyribonucler d.脱氧核 3.9 EMBL：The european molecular biologylaboratory，欧洲分子生物学实验室。 3.10 ）Genbank：基因库。 3.11ITS：Internaltranscribedspacer，内转录间隔区。 3.12 2PCR：Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。 4原理 依据黄曲霉在AFPA和察氏培养基的培养性状，以及真菌鉴定通用引物、曲霉属菌鉴定引物与黄曲 霉特异性DNA序列的PCR检测结果作为鉴定黄曲霉的主要依据。 5实验室基本要求和生物安全 GB19489的有关规定执行。 警示：应具有相应的微生物专业教育或培训经历的技术人员进行黄曲霉的培养和鉴定。操作过程中防止交叉污染，所 1 NY/T3691—2020 有培养物及培养器Ⅲ需经121℃高压灭菌30min后，先用0.1%次氯酸钠溶液浸泡处理再充置。 6仪器设备及试剂材料 6.1仪器设备 除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备如下： 生物安全柜、高压灭菌锅、恒温培养箱、烘箱、微型粉碎机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、制冰机、 析仪、凝胶电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器等。 6.2试剂与材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682的相关要求。 DG18培养基、察氏培养基及AFPA培养基配制方法见附录A；分子生物学鉴定所用试剂及配制方法 见附录B和附录C。 7黄曲霉鉴定 7.1样品处理 称取10g待检样品，用研钵或微型粉碎机轻微破碎，加入含90mL无菌水的锥形瓶中，室温涡旋振荡 或水平摇床上充分混匀，加无菌水定容配制100mL样品基础液。吸取1mL配制的基础液加人含9ml 无菌水的离心管中，按照GB4789.15，依次10倍梯度稀释，分别得到1×10-1、1×10-2、1×10-3、1X 10-4、1×10-5稀释度的菌悬液。 7.2黄曲霉分离与纯化 按照GB4789.15,吸取每个稀释浓度的菌悬液100μL涂布于DG18培养基平板上，置于恒温培养 箱，在28℃、相对湿度90%、黑暗条件下培养3d～5d，每个稀释度处理重复3次。挑取外观长有黄绿色 孢子的菌落转接至新的DG18培养基平板上进行二次划线纯化培养，直至得到单菌落，为霉菌的纯培养物 （待测菌株），培养条件同上。 7.3黄曲霉鉴定方法 7.3.1形态鉴定 7.3.1.1AFPA培养鉴定 将7.2中待测菌株接种于选择性培养基AFPA平板上，培养条件同7.2。将平板倒转，培养3d～5d， 观察菌落背面颜色，选取菌落背面呈亮橙色的菌株，备用。 7.3.1.2察氏培养基培养鉴定 根据GB4789.16，刮取7.3.1.1中亮橙色菌落转接于察氏培养基，培养5d～7d后观察菌落形态、 颜色，用生物显微镜观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征和孢子的排列等，培养条件同7.2。 7.3.2分子生物学鉴定 7.3.2.1DNA提取 从7.3.1.2培养皿上刮取待测菌株菌丝体，使用市售真菌基因组DNA提取试剂盒并按照其操作说 明快速提取DNA，或使用CTAB法提取DNA，具体步骤及试剂见附录B。使用核酸蛋白仪或紫外分光光 度计进行DNA浓度和纯度检测。提取的DNA溶液保存于一20℃备用。 7.3.2.2PCR扩增 以7.3.2.1中待测菌株DNA为反应模板，以黄曲霉标准菌株DNA作为阳性对照，用真菌鉴定通用 引物ITS1/ITS4对待测菌株ITS序列进行PCR扩增分析；选择曲霉属真菌鉴定引物CF1/CF2或BA1/ BA2对待测菌株Calmodulin基因部分片段或β-tubulin基因部分片段进行PCR扩增分析；用黄曲霉特异 性鉴定引物进行PCR扩增验证。PCR引物序列、产物大小、反应体系及反应条件见附录C。 7.3.2.3PCR产物检测 2 NY/T3691—2020 待测菌株样品是否在预期位置产生明显条带。 7.3.2.4PCR结果分析 对PCR产物进行测序，将测序结果在GenBank或EMBL等国际核酸数据库中进行BLAST序列比 对分析，确定待测菌的种属信息。 8 结果判定 符合以下条件者，可判定待测菌株为黄曲霉，即样品检出黄曲霉。 8.1形态鉴定结果判定 待测菌株在AFPA培养基背面呈亮橙色的特征性菌落，在察氏培养基上符合GB4789.16中对黄曲 霉的描述，即菌落呈致密丝绒状，有的菌株形成少量或大量菌核，分生孢子颜色为黄绿色至草绿色，呈球形 或近球形，分生孢子头初为球形，后呈辐射形，分生孢子梗生自基质。 8.2 2分子生物学鉴定结果判定 PCR扩增的ITS、Calmodulin或β-tubulin基因产物为特异性DNA条带，序列在国际核酸数据库中 比对结果与AspergillusJlavus同源性最高（Ident>99%），且黄曲霉特异性扩增产物为特异性DNA条 带，片段大小与阳性对照一致（非黄曲霉无特征性条带出现）。 3 NY/T3691—2020 附录A （资料性附录） 培养基和试剂 A.1DG18培养基 A.1.1成分 PUBLI 酪蛋白陈 无水葡萄糖 KH,PO. MgSO,:H20 氯硝胺 0. 002 g 琼脂 A.1.2制法 S 准确称取 述试 剂及无 水H油200g浴鲜手600m蒸留水小最后定 mL 混匀后分装于 三角瓶中，121° 15 mi 冷至50c若时每200m培养基中加人 火 溶液 (20 mg)。 A A. 2 察氏培养基（ DoxAgar) A.2.1成分 U NaNO: K,HPO KCI MgSO.71 FeSO,· 7H2 GRI 燕糖 琼脂 蒸馏水 A.2.2制法 量取600mL蒸馏水分别加人蔗糖、NaN K,HI 、MgSO H20、FeSO·7H20,依次逐 一加入水中溶解后加人琼脂，加热融化.补加蒸馏水定容至1000mL，分装后，121℃灭菌15min。 A. 3 3AFPA培养基 A.3.1成分 蛋白陈 10.0 g 酵母浸粉 20.0 g 柠檬酸铁铵 0.5 g 氯硝胺 0.002 g 氯霉素 0.1 g 琼脂 15.0 g A.3.2制法 量取600mL蒸馏水分别加入蛋白陈、酵母浸粉、柠檬酸铁铵、氯硝胺、氯霉素，依次逐一加入水中溶 解后加入琼脂，加热融化，补加蒸馏水定容至1000mL，分装后，121℃灭菌15min。 4 NY/T3691—2020 附录B (资料性附录） CTAB法提取DNA B.1试剂及配制 B.1.1液氮：保持研磨时的低温环境，保护核酸不受核酸酶降解。 B.1.21mol/LTris-HCl:用800mL超纯水溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加浓盐酸调节pH， 调至8.0，加水定容至1L。 B.1.3CTAB提取液成分:0.1mol/LTris-HCl(pH=7.5),10mol/LEDTA(pH=7.5),2%十六烷基 三甲基溴化铵（CTAB)，0.7mol/LNaCl,1%β-巯基乙醇。 B.1.40.5mol/LEDTA（pH=8.0）：将186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2:2H2O)加人 800mL水中，搅拌溶解，用NaOH调节pH至8.0，定容至1L。 B.1.570%乙醇：量取70mL无水乙醇，加灭菌超纯水定容至100mL，备用。 B.2提取步骤