ICS 07.080 B 47 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3677—2020 家蚕微孢子虫荧光定量PCR 检测方法 Real time PCRmethodfor detection of Nosema bombycis 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3677—2020 前言 本标准由农业农村部种植业管理司提出。 本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会（SAC/TC437）口。 本标准起草单位：江苏科技大学、中国农业科学院蚕业研究所、苏州大学、西南大学、农业农村部蚕桑 产业产品质量监督检验测试中心（镇江）。 本标准主要起草人：吴萍、沈中元、郭锡杰、张少伦、贡成良、潘敏慧、陈涛、商琪。 I NY/T3677—2020 家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法 1范围 本标准规定了家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）的实时荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于家蚕蚕卵及家蚕幼虫组织中微孢子虫的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应 月是必不可 少的 日期的引用文件个 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件 GB/T6682 分析实验室 用水规标和试 3术语和定义 Q 下列术语和定 用于义 3. 1 LUSrRNA基因 家蚕微孢子 内大亚基 糖体RN 3. 2 Ct值cyele 每个管内 光信 号达到 3.3 FTA卡滤膜 弗林德斯技术 4原理 根据家蚕微孢 的uys RNA 内的保守序列设计特异性引物进荐 反应。利用荧光信 号伴随目的PCR产物的 曾加而增强 单过程的带 信号码 Ct值判断供试样品 是否含有家蚕微孢子虫 5试剂与材料 除另有规定外，所用生化试剂均为分 分析纯，实验用水应符合GB 6682中一级水的规定。 5.1Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)：称取12.10gTris碱至烧杯中，加人90mL超纯水溶解，加人适量浓 HCI调pH至8.0，定容至100mL，高压灭菌，室温保存。 5.2EDTA（0.5mol/L，pH8.0)：称取18.61gEDTA溶于90mL超纯水中，加人适量NaOH调节pH 至8.0，定容至100mL，高温灭菌后保存。 5.3TE缓冲液：分别量取5.1溶液5.0mL、5.2溶液1.0mL于烧杯中，加人400mL超纯水均匀混合 后，定容至500mL，高压灭菌，室温保存。 5.4TE-1缓冲液：分别量取5.1溶液5.0mL、5.2溶液0.1mL于烧杯中，加人400mL超纯水均匀混 合后，定容至500mL，高压灭菌，室温保存。 5.530%KOH溶液：称取30.00gKOH至烧杯中，缓慢加人超纯水搅拌溶解后，定容至100mL，高压 灭菌，室温保存。 5.6玻璃珠（直径1.0mm）。 1 NY/T3677—2020 5.7FTA卡滤膜片。 5.8FTA纯化试剂。 5.9荧光定量PCR试剂盒。 5.10 0灭菌的枪头、离心管及牙签。 6主要仪器设备 6.1实时荧光定量PCR仪。 6.2紫外分光光度计。 6.3小型珠磨式组织研磨器。 6.4破碎管。 6.5微量加样器。 6.6微型打孔器。 6.7-20℃及-80℃冰箱。 7样品检测 7.1样品微孢子虫基因组DNA提取 7.1.1将待检蚕卵样品充分混勾，随机选取200粒蚕卵用30%KOH溶液在37℃中浸没10min，一级水 冲洗2次，1mol/LHCI中和1次，一级水冲洗2次，用灭菌牙签将蚕卵充分捣碎。称取待检蚕体组织约 200mg，在冰上快速用灭菌剪刀将其剪碎。 7.1.2将7.1.1处理过的蚕卵样品或蚕体组织样品置于2mL破碎管中，加人1/2管体积的玻璃珠及 后再重复振荡破碎5次。 7.1.3吸取100μL破碎液滴加到FTA卡滤膜片上，室温干燥。 TE-1缓冲液洗涤2次，56℃干燥后一20℃冷冻保存备用，作为荧光定量的模板。 7.2实时荧光定量PCR检测 7.2.1引物序列 正向引物：5'-GGATCAATAGGATGTCATAACG-3'; 反向引物：5'-TGTTCATTCGCCACTACTAA-3。 荧光定量PCR产物相关信息参见附录A。 7.2.2对照设置 阳性对照：含有经7.2.1引物扩增的LSUrRNA基因片段的重组质粒DNA，拷贝数为1.0X10°个/μL。 阳性质粒的制备参见附录B。 阴性对照：健康家蚕幼虫基因组DNA，浓度为50ng/μl。 空白对照：灭菌超纯水。 7.2.3PCR反应体系 实时荧光定量PCR反应体系见表1。 表1实时荧光定量PCR反应体系 试剂 体积/单个反应 2XSYBR Premix ExTaqTM 12. 5 μL 正向引物（10μmol/L） 0. 5 μL 反向引物（10μmol/L） 0. 5 μL 2 NY/T3677—2020 表1 (续) 试剂 体积/单个反应 DNA模板 1个FTA卡滤膜片 一级水 补足至25μl 总体积 25μL 注：DNA模板若为阳性质粒与阴性对照，单个反应的体积均为1μL。 反应程序：95℃预变性2min，95℃5s，60℃31s，共40个循环。每个样品重复3次。可按照其他市 售商品化试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。 7.2.4PCR反应质量控制 扩增反应结束后，阳性对照出现典型的扩增曲线，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直或低于阳性对 照荧光值的15%，表明反应体系工作正常。否则，表明PCR反应体系不正常，应重新检测。 8 结果判定 在PCR反应体系正常工作的前提下，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。判定规则如下： a）待测样品检测Ct值小于或等于阳性对照的Ct值，判定该样品检出家蚕微孢子虫； b) 待测样品检测Ct值大于或等于阴性对照的Ct值，判定该样品未检出家蚕微孢子虫； 待测样品检测Ct值大于阳性对照的Ct值且小于阴性对照的Ct值，应重新做荧光定量PCR扩 增，若重复实验结果出现典型的扩增曲线，Ct值仍然在此范围，判定该样品疑似含有家蚕微孢 子虫。 3 NY/T3677—2020 附录A (资料性附录) 荧光定量PCR产物相关信息 A.1检测基因 家蚕微孢子虫LUSrRNA基因：GenBank登录号：AY259631(142b A.2 扩增产物大小及序列 扩增产物160bp GGATCAATAG GAT TO A GATAAAACATAATCT TTGAATTCTAAT FC CCCTTTGAACI GTAAAAGGAGGAA AAGAAACTAA A GCO AACA 注：划线部分为引 NY/T3677—2020 附录B （资料性附录） 阳性质粒的制备 B.1以家蚕微孢子虫的基因组DNA为模板，用LUSrRNA基因的正向引物和反向引物扩增目的基 因片段，PCR反应体系25L：10×PCR缓冲液2.5uL，dNTPs（各10mmol/L)0.5uL，正、反向引物 应条件为：94℃2min；94℃30s，55℃40s，72℃40s，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，取5μL PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。 B.2PCR产物经电泳鉴定后，按试剂盒说明书进行胶回收纯化目的片段，将目的片段与克隆载体连接， 将其转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒并进行测序验证。 B.3阳性质粒用碱裂解法进行提纯，用紫外分光光度计分别测定OD260与OD280的吸光值，根据OD260的 值计算质粒浓度，质粒拷贝数按式（B.1)计算。质粒纯度用OD260/OD280值表示，比值应为1.80～2.00。 C=NAXP (B.1) 式中： c 质粒拷贝数的数值，单位为质粒拷贝数每毫升（个/mL）； NA- 阿伏伽德罗常数，通常表示为6.02X1023，单位为物质所含的基本单元（分子或原子)的数量 每摩尔（个/mol）； 质粒浓度的数值，单位为克每毫升（g/mL）； m 质粒平均分子量的数值，单位为克每摩尔（g/mol)。 B.4将阳性质粒拷贝数稀释至1.0×101个/uL，置于一20℃冰箱保存备用，保存期限宜在3个月内；长期 保存应置于一80℃冰箱。 5