ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3655—2020 饲料中N一羟甲基蛋酸钙的测定 Determination of N-Hydroxymethyl methionine calcium in feeds 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3655—2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出， 典迎 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 （北京）。 本标准主要起草人：索德成、赵小阳、贾铮、赵根龙、杨希国。 NY/T3655—2020 饲料中N-羟甲基蛋氨酸钙的测定 1范围 本标准规定了测定反台动物饲料中N-羟甲基蛋氨酸钙的高效液相色谱法和氨基酸分析仪法。 本标准适用于牛、羊精料补充料和预混合饲料中N-羟甲基蛋氨酸钙的测定，不适用于加有蛋氨酸或 蛋氨酸盐的产品。 本标准定量限为20.0mg/kg。 2规范性引用文件 PUBL 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的 GB/T6682 验方法 GB/T18246 2009 饲料中氨基酸的测定 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 S 3高效液相色谱法 3.1原理 用盐酸溶液将 N甲 基蛋氨酸钙水解成蛋氨酸，水解液经固相萃取柱净化 进石柱 柱前衍生后用高效 液相色谱法进行测 CH 定，外 3.2试剂或材料 CENT 除方法另有 规 定外试 均为分析 3.2.1水：GB 6682 3.2.2甲醇：色 3.2.3乙睛：色谱细 3.2.42,4-二硝基氯 溶液( 硝基氯苯0:30g·加乙溶解片定 至10mL。临用前 9 配置。 人 注：二硝基氯苯具有毒性 为皮肤致敏物，避免皮肤直接接触，如有接触，用酒精擦拭。 动清水冲洗。 3.2.5盐酸溶液（0.1mol/L） 取8.3mL盐酸于1000mL容量瓶中，用水定 容至刻度。 3.2.6碳酸盐缓冲液（1.0mol pH=9.0 称取无水碳酸钠53g及碳酸氢钠42g溶于水中稀释至 1000mL，用1mol/LNaOH溶液调节至pH9.0。 3.2.7乙酸钠溶液：称取1.25g无水乙酸钠，用水溶解后定容至1000mL,混匀，用0.45μm滤膜过滤。 3.2.8N-羟甲基蛋氨酸钙标准储备溶液（1000μg/mL)：准确称取N-羟甲基蛋氨酸钙对照品（纯度≥ 95%)0.1g（精确至0.0001g），用盐酸溶液（3.2.5）配制成浓度为1000μg/mL的标准储备液。2℃~ 8℃下避光保存备用，有效期为6个月。 3.2.9N-羟甲基蛋氨酸钙标准工作溶液：根据需要，用水稀释标准储备溶液，配制成浓度为2μg/mL、 5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的标准工作溶液。临用现配。 3.2.10固相萃取柱：Ci8固相萃取柱（60mg/3mL），或性能相当者。 3.2.11水相滤膜：0.45μm。 3.3仪器设备 3.3.1超声波提取器。 1 NY/T3655—2020 3.3.2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。 3.3.3离心机：转速不低于5000r/min。 3.3.4高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。 3.3.5涡旋混合仪。 3.3.6恒温水浴：可控温度达80℃。 3.4样品 按照GB/T20195制备样品，全部通过0.28mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，备用。 3.5试验步骤 3.5.1试样提取 平行做2份实验。准确称取2g（精确到0.001g)，置于50mL离心管中，准确加人盐酸溶液（3.2.5) 20mL，涡旋30s，超声提取30min，然后于离心机上5000r/min离心5min，取上清液备用。 3.5.2净化 固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，抽干，取5mL上清液（3.5.1)，过柱。收集流出液至 10mL试管内，涡旋混匀，备用。 3.5.3衍生 准确吸取试液（3.5.2）1mL加人10mL具塞棕色玻璃管中，分别加人碳酸盐缓冲液（3.2.6)2mL， 2,4-二硝基氯苯溶液（3.2.4)0.1mL,用涡旋混合仪混匀，置于80℃恒温水浴锅中，避光反应1h，取出，冷 却至室温，用水稀释至10mL，混匀。过0.45μm滤膜，上机测定。 另准确移取2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL标准工作 液（3.2.9)各1mL，从分别加入碳酸盐缓冲液开始，按上述方法衍生，过0.45μm滤膜，上机测定。 3.5.4测定 3.5.4.1高效液相色谱参考条件 色谱柱：Cis柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度5.0μm，或性能相当者。 柱温：30℃。 流动相：乙酸钠溶液（3.2.7)十乙=90十10。 流速：0.50mL/min。 进样量：20μL。 检测波长：350nm。 3.5.4.2测定 依次测定N-羟甲基蛋氨酸钙标准系列溶液和试样溶液。以保留时间定性，试样中待测物质保留时 间与标准溶液中对应保留时间偏差在士2.5%之内。以色谱峰面积定量，作单点或多点校准。多点校 准时，其标准曲线相关系数应大于或等于0.99；单点校准时，试样溶液中待测物的响应值应与标准溶液 中待测物的响应值接近（差异在士30%之内）。试样溶液中待测物的响应值应在标准曲线的线性范围 之内，若超出线性范围，需将其稀释后重新测定。N-羟甲基蛋氨酸钙标准溶液的高效液相色谱图参见 附录A。 3.5.5试验数据处理 试样中N-羟甲基蛋氨酸钙的含量以w;计，数值以毫克每千克（mg/kg)表示，单点校正按式（1)计算， 多点校正按式(2)计算。 A,XpsXn =1m A,Xm (1) 式中： A 试样溶液峰面积值； Ps 标准溶液中N-羟甲基蛋氨酸钙的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； n 稀释体积，单位为毫升（mL）； 2 NY/T3655—2020 A。——标准溶液峰面积值； m 称取饲料的质量，单位为克（g）。 paXn w (2) m 式中： 标准曲线上查得的试样中N-羟甲基蛋氨酸钙的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。 3.5.6精密度 在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。 4 氨基酸分析仪测定法（仲裁法） 4.1原理 利用盐酸溶液将N-羟甲基蛋氨酸钙水解成蛋氨酸，水解液经固相萃取柱净化，用氨基酸分析仪进行 测定，外标法定量 4.2试剂或材料 同3.2。 4.3仪器设备 4.3.1氨基酸分析仪。 4.3.2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。 4.3.3离心机：转速不低于5000r/min。 4.3.5涡旋混合仪。 4.3.6恒温水浴锅：（80士1)℃。 4.4样品 同3.4。 4.5试验步骤 4.5.1试样提取 同3.5.1。 4.5.2净化 同3.5.2。 4.5.3测定 取4.5.2净化所得的溶液，以及N-羟甲基蛋氨酸钙标准溶液于氨基酸分析仪上，按GB/T18246- 2000中7.2的规定进行测定，用标准系列进行单点或多点校准。样品溶液中待测物的响应值均应在仪器 测定的线性范围内。N-羟甲基蛋氨酸钙标准溶液的氨基酸分析法色谱图参见附录A。 4.6试验数据处理 试样中N-羟甲基蛋氨酸钙的含量以w;计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，单点校正按式（3） 计算。 (3) A,Xm 式中： A! 试样溶液中N-羟甲基蛋氨酸钙的峰面积值； ps 标准溶液中N-羟甲基蛋氨酸钙的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)； n' 稀释体积，单位为毫升（mL）； A'- 标准溶液中N-羟甲基蛋氨酸钙的峰面积值； 样品的质量，单位为克（g）。 3 NY/T3655—2020 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。 4.7 精密度 在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的10%。 十 NY/T3655—2020 附录A (资料性附录） N-羟甲基蛋氨酸钙标准图谱 N-羟甲基蛋氨酸钙标准溶液(10μg/mL)的液相色谱图和氨基酸分析仪法的色谱图分别见图A.1、图 A.2。 响应值，mV N-羟甲基蛋氨酸衍生 产物的色谱峰 衍生剂色谱峰 10 14 ,min 图A.1 N-羟甲基蛋氨酸标准溶液(10μg/mL)的液相色谱图 响应值，mV 540 31.247 Met 480 420 360 300 240 180 120 60 -60 18 27 36 45 54 I,min 图A.2 N-羟甲基蛋氨酸钙标准溶液(10μg/mL)的氨基酸分析仪法的色谱图 5