ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3642—2020 桃品种鉴定 SSR分子标记法 Identification of peach cultivars using SSR markers method 2020-07-27 发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3642—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4. 主要仪器设备及试剂 5 溶液配制 6 引物相关信息及使用 7 参照品种及其使用 操作程序 结果统计 10判定方法 附录A（规范性附录） 主要仪器设备及试剂. 附录B(规范性附录) 溶液配制： 附录C(规范性附录) 核心引物名单及序列· 附录D(资料性附录) 核心引物相关信息 附录E(资料性附录) 参照品种名单及来源 NY/T3642—2020 典通 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院郑州果树研究所。 本标准主要起草人：王力荣、曹珂、朱更瑞、方伟超、陈昌文、王新卫、关利平。 NY/T3642—2020 桃品种鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用简单重复序列(Simple sequencerepeats,SSR)分子标记进行桃品种鉴定的操作程 序、数据采集和判定方法。 本标准适用于桃（PrunuspersicaL ）品种及其近缘野生种的SSR指纹数据的采集及品种鉴定。 2规范性引用文件 件，仅注日期的版本适用于本文件。 NY/T2341 植物新品种特异性 致性和稳 测试指南 NY/T2594 植物品种鉴定 标记法 总则 3术语和定义 NY/T2594 3. 1 核心引物 corephimer 品种鉴定中位 尤先选用 餐SSR引物·具有多态性高，重复性好等综合特 3. 2 U 参照品种 对应于特 变异扩增片段 的大小，校正不 4主要仪器设备及 见附录A。 R 人 5溶液配制 见附录B。 6引物相关信息及使用 引物名单及序列见附录C，引物等位变异等 7参照品种及其使用 参照品种的名称及其相关信息参见附录E。在进行待测样品的等位变异检测时，应同时包括相应参 照品种的PCR扩增产物的检测。 注1：同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原参照 品种核对，确认无误后使用。 注2：对于附录D中未包括的等位变异，应按本标准方法，通过使用DNA分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小。 8操作程序 8.1样品制备 每份样品中至少随机抽取3个单株，混合后用于鉴定分析。当一致性结果较差时，进行单独取样分析。 1 NY/T3642—2020 8.2DNA提取 a）称取桃新鲜幼嫩叶片1.0g，用无菌双蒸水清洗干净，装人2mL带0.5mm直径钢珠的离心管 中，放入液氮中预冷，将预冷后的离心管放入高通量组织研磨仪中进行冷冻研磨，45Hz研磨90 S，至粉末状后，依次加人400μL在65℃水浴中预热的2%CTAB裂解缓冲液、40uLβ-基乙 醇，充分摇匀； b）离心管置于65℃恒温水浴中保温45min，期间每隔10min轻轻转动离心管，取出离心管，4℃ 12000g离心5min； c)1 取上清液至新的无菌2mL离心管，加人等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1,V：V：V)，颠 倒混匀2min~3min，静置10min，4℃12000g离心10min； d) 再次取上清液，转入新离心管中，加人等体积的氯仿-异戊醇（24：1，V：V），颠倒混匀2min3 min，静置10min，4℃12000g离心10min; e） 轻轻地吸取上清液，转人新离心管中，加人1/10体积的3mol/L醋酸钠溶液，2.5倍体积一20℃ 预冷无水乙醇，将离心管慢慢上下摇动30s，一20℃静置30min至能见到DNA絮状物； f）4℃12000g离心2min，立即倒掉上清液，加人800μL75%乙醇，用手指轻弹管尖，使DNA沉 淀漂浮于液体中，静置5min； g)4 4℃12000g离心2min，弃上清液，再加人800μL75%的乙醇，重复清洗DNA2次； h) 将离心管置于超净工作台干燥，风干约5min； i) 加人250μL0.5×TE缓冲液，4℃溶解DNA10min；加入1μL10mg/mL的RNaseA，涡旋混 匀，置于37℃温浴30min，消解RNA； j) k）车 水乙醇，颠倒混匀，一20℃静置30min； 1）4℃12000g离心2min，沉淀用75%乙醇洗2次～3次，室温下风干，溶于250μL双蒸水， 一20℃保存、备用。 注：以上为推荐的DNA提取方法，其他营养器官以及达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。 8.3PCR扩增 8.3.1反应体系 PCR反应体系为10μL：10XPCRbuffer1μL,2.5mmol/LdNTP0.8μL,5'FAM荧光标记的正反 向引物的混合物0.6μL,DNA样品（20ng/μL～30ng/μL)1μL,5UTaqDNA聚合酶0.1μL，超纯水 6.5μL。 引物信息见附录C。 8.3.2反应程序 95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；4℃保存备用。 8.4PCR产物检测 8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE） 8.4.1.1清洗玻璃板 清洗玻璃板，用去离子水冲净后晾干备用。用之前再用95%乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。在长板上 涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止2块玻璃板 互相污染。 8.4.1.2组装电泳板 待玻璃板彻底干燥后，在两侧放好衬条对齐，用固定夹加紧两块玻璃板，并用水平仪调平。 8.4.1.3制胶 在60mL6%PAGE胶液中分别加入600μL10%的过硫酸铵和60μLTEMED,轻轻混匀后。将玻 璃模具倾斜，用注射器吸取胶液缓慢诸如两玻璃板之间的空隙，灌胶过程防止气泡产生。待胶液充满玻璃 2 NY/T3642—2020 板夹层后，将0.4mm厚鲨鱼齿梳齿平齐端向里轻轻插入胶液约0.4cm。胶液在室温下聚合2h以上。 胶聚合后，放人电泳槽，凹型玻璃紧贴电泳缓冲液槽，用大号固定夹固定住两侧。在上下电泳槽内灌入1× TBE电泳缓冲液。清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以除去可 能存在的未聚合的聚丙烯酰胺和气泡。 8.4.1.4电泳 每一个加样孔点人变性后的2μL～4μL扩增产物和1uL6×LoadingBuffer混合液，在胶板两侧点 人DNAMarker。除待测样品外，还应同时加入参照品种的扩增产物。在50W～60W恒功率下电泳，使 凝胶温度保持在约50℃。电泳1.5h～2.0h电泳时间取决于扩增片段的大小范围），同时观察溴酚蓝电 泳至胶板底部位置即可。 注：具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定 8.4.1.5银染 a) 漂洗：取出胶板 馏水漂洗2次，每次漂洗改； b) 染色：从水洗框中取出胶板 30 c) 漂洗：取出胶板，放又水 蒸馏水漂洗一次，日 d) 显影：将 胶板放人显影液中在床上3 /min显影 定影：待条 带清晰后 将胶板放人 周定液！ f）漂洗： 用蒸馏水漂 胶板10室温下自然干烧 8.4.2DNA 分析仪检测 8.4.2.1POR产 物样品制备 等体积混 光标记扩增产物，混匀后从混合液中吸取工工加人 中，每孔另外 马手甲酰胺和0.5LROX-500分子量内标 川 min,将双链变 瞬时离心10s后上机检测。 8.4.2.2上机检测 C 参考机器操 标准打 开DNA分析仪检查仪器工作状态： 将装有样品的深孔 板置于样品架基 按照仪器操作程序制作板标， 输人群本线 编号或名称。启动程 序，DNA分析仪自 动 收集记 C 9结果统计 9.1数据表示 样品每个SSR位点的等位变异采用护增片段大小的形式表。 9.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 与银染检测 将待测样品某一位点扩增片段的带型和迁移位置与对应的参照品种进行比较，根据参照品种的迁移 位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小 9.3毛细管电泳荧光检测 使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异大小数据。通过使用53个参 照品种中的适宜材料，消除不同批次或不同型号DNA分析仪之间可能存在的系统误差。比较参照品种 的等位变异大小数据与附录D中的相应数据。两者的差数为系统误差的大小。从待测样品的等位变异 数据中去除该系统误差，获得的数据即为待测样本的等位变异大小。 9.4结果记录 纯合位点的基因型数据记录为X/X,杂合位点的基因型数据记录为X/Y,其中X、Y分别为该位点上 两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0。 示例1：一个品种的一个SSR位点为纯合，等位变异大小为120bp，则该品种在该位点上的等位变异数据记录为120/ 120。 3 NY/T3642—2020 示例2：一个品种的一个SSR位点为杂合位点，2个等位变异大小分别为140bp和180bp，则该品种在该位点上的等 位变异数据记录为140/180。 10判定方法 10.1 结果判定 用附录C中的10对引物进行检测，获得待测样品和参照品种在这些位点的等位变异记录数据，每份 样品