ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3641—2020 欧洲甜樱桃品种鉴定 SSR分子标记法 Identification of sweet cherry varieties using SSR marker method 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3641—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 术语和定义 仪器设备及试剂 溶液配制 引物相关信息及使用· 参照品种及使用 8 操作程序 9数据记录与统计 10判定方法 附录A（规范性附录) 仪器设备及试剂 附录B(规范性附录) 溶液配制· 附录C(规范性附录) 核心引物名单及序列， 附录D(资料性附录) 核心引物相关信息 NY/T3641—2020 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布抗构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院郑州果树研究所。 本标准主要起草人：李明、刘聪利、齐希梁、李玉红、宋露露。 NY/T3641—2020 甜樱桃品种鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR）标记的遗传多态性进行欧洲甜樱桃 （PrunusaviumL.）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定规则。 本标准适用于欧洲甜樱桃品种的SSR指纹数据采集及品种鉴定。 2 规范性引用文件 牛，仅注日期的版本适用于本文件。 所有 NY/T2594 分子标记 总则 NY/T3056 植物品种特开 性和稳定性测试指南 3术语和定义 NY/T2594 列术语和定义适用 3. 1 4 核心引物 品种分子鉴先 定优先递 ?重复性好等综合特性 - 品种DNA指纹数 据采集和品种鉴 3. 2 参照品种 对应于特定位 点不同等位变异的一 组品种 用于辅助 等位变异扩增片段 的大小，校正仪器 备的系统误 R 仪器设备及试剂 U 见附录A。 5溶液配制 见附录B。 6引物相关信息及使用 核心引物名单及序列见附录C,核心引物相关信息见附录D。 7 参照品种及使用 参见附录D。 操作程序 8.1样品制备 每个品种检测3个单株，进行混样分析。当一致性结果较差时，进行单独取样分析。 8.2DNA提取与检测 采用CTAB法。选取欧洲甜樱桃幼嫩叶片或芽（0.2g左右)在液氮中研磨至粉末，迅速将粉末移人 1 NY/T 3641—2020 2.0mL离心管；每管加人700μL65℃预热的2%CTAB缓冲液，轻摇混匀；65℃水浴30min，期间多次 颠倒混匀以确保充分裂解。于4℃12000g离心10min；取上清液，每管加人等体积的氯仿-异戊醇（24： 1)混合液，充分混匀后，12000g离心10min；取上清液到新的2mL离心管中，再加入1mL一20℃预冷 的异丙醇，颠倒混匀沉淀DNA，并于一20℃条件下放置30min以上，于4℃12000g离心15min，弃上清 液；用75%乙醇浸泡清洗沉淀2次，风干，将沉淀物溶解于200μL灭菌超纯水中，使用核酸蛋白浓度测定 仪进行浓度测定，一20℃保存备用。 注：以上为推荐的一种DNA提取方法。所获DNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。 8.3PCR扩增 8.3.1引物选择 选择附录C中17对引物进行检测。 8.3.2反应体系 10μL反应体系：DNA1μL(30ng/μL)、10XPCR反应缓冲液（含Mg2+)1μL、dNTP0.8μL(2.5 mmol/L）、正反向引物各0.4μL(10μmol/L),Taq酶0.2μL(5U/μL)，灭菌超纯水6.2μL，在PCR扩 增仪上进行扩增。 利用毛细管电泳荧光检测时使用荧光标记的引物，引物的荧光染料种类参见附录D。 注：反应体系的体积可以根据具体的情况进行调整。 8.3.3反应程序 95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃下延伸10min 4℃保存。 8.4PCR产物检测 8.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）检测 8.4.1.1清洗玻璃板 将玻璃板清洗干净，用去离子水冲洗后晾干。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。在长板上涂 0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止2块玻璃板互 相污染。 8.4.1.2组装电泳板 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。 8.4.1.3制胶 在60mL6.0%PAGE胶液中分别加入600μL10%的过硫酸铵和60μLTEMED,轻轻混匀后，灌 胶。灌胶过程中防止出现气泡。待胶液完全充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳齿平齐端向里轻轻 插入胶液约0.4cm。胶液在室温下聚合1h以上。胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子， 用水清洗干净备用。 8.4.1.4预电泳 将胶板安装于电泳槽上，在正极槽（下槽)中加人1XTBE缓冲液约800mL，在负极槽（上槽）加人预 热至65℃的1XTBE缓冲液约800mL。在85W恒功率下，预电泳10min~20min。 8.4.1.5样品制备 在10μLPCR产物中加入2μL6X加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上95℃变性5min，取出，迅速置 于冰上。 8.4.1.6电泳 用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质。将鲨鱼齿梳子梳齿端插人凝胶1mm～2mm。每一个加样 孔点入2μL～4μL扩增产物，在胶板两侧点入DNAMarker。除待测样品外，还应同时加入参照品种的 扩增产物。以30V/cm～40V/cm的电压电泳，使凝胶温度保持在约50℃。电泳时间1.5h~2.5h（电 泳时间取决于扩增片段的大小范围）。 8.4.1.7银染显色 2 NY/T3641—2020 电泳结束后，小心分开2块玻璃板，将凝胶附着的长玻璃板放入固定液中，使固定液没过凝胶，轻摇 3min；取出胶板，用蒸馏水快速漂洗2次，每次漂洗不超过10s，放人染色液中，轻摇5min～10min进行 染色；然后从染色液中取出，用双蒸水快速漂洗，放人显影液中，轻摇至显色出清晰条带；取出后迅速将凝 胶放入固定液中定影5min，用双蒸水冲洗2遍，取出后沥干，扫描或拍摄成像。 8.4.2毛细管电泳荧光检测 8.4.2.1样品准备 分别取等体积稀释后的不同荧光标记扩增产物溶液混合，从混合液中吸取1uL加入DNA分析仪深 孔板中。板中各孔分别加人0.1μLLIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。除待测样品外，还应 同时包括参照品种的扩增产物。将样品在PCR仪上95℃变性 min，取出并立即置于冰上冷却10min 以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上 8.4.2.2荧光检测 PUB 数据记录与统计 9.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测 将待测样品每个 扩增位点 的等位变外 确定待测样品在该 位点的等位基因扩增片段大 9.2毛细管电泳荧光检测 使用DNA 小 据。 通过使用参 照品种，消除同型 较 照品种的等位 变异片段大小 村录 中的相应数据，两者的差数为系统误差的大小从待测 等 变异数据中去 除该系统误差， 得 #的数据 9.3结果记录 数据的记录和统计 纯合位点的基因型数据记录为X/x,其中 点等位变异的 金位 的 基因型数据记录 为X/Y,其中X 为该位点 同的等位变异多小 全段在前，大片段 立点等位基因变异 数据记录为0/0。 示例1：品种“莫 FEMPAS 正位点上扩增出 型记录为80/80。 示例2：品种“红灯 PceA25位点上有两个等位变异 分别为192 品种在该位点上的基因型记 录为192/196 10判定方法 10.1 结果判定 利用附录C中17对核心引物检测，获得待测样品在上述引物位点的等位变异数据，利用这些数据和 数据库中品种进行比较： a）品种间差异位点数≥2,判定为“不同品种”； b）品种间差异位点数=1,判定为“近似品种” c）品种间差异位点数=0，判定为“相同品种或极近似品种”。 对于10.1b)和10.1c)的情况，应按照NY/T3056的规定进行田间DUS测试，确定品种间在形 态性状上是否存在明显差异。 10.2结果表述 待测样品 与对照样品 利用 分子标记类型，采用 检测平 台，采用 位点组合进行检测，结果显示：检测位点数为 ，差异位点数为 判定为 （相同或极近似、近似、不同）。 3 NY/T3641—2020 附录A （规范性附录） 仪器设备及试剂 A.1主要仪器设备 A.1.1PCR扩增仪。 A. 1. 2 2DNA分析仪：基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件。 A.1.3垂直电泳槽及配套的制胶配件。 A.1.4电泳仪。 A. 1.5 高速冷冻离心机。 A. 1. 6 研钵。 A. 1.7 水平摇床。 A.1.8胶片观察灯。 A. 1. 9 电子天平：感应精度为0.01g、0.001g。 A. 1. 10 pH酸度计。 A. 1. 11 微量移液器：规格分别为2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。 A. 1. 12 磁力搅拌器。 A. 1. 13 核酸蛋白浓度测定仪。 A. 1. 14 水浴锅。 A. 1. 15 制冰机。 A. 1. 16 普通冰箱。 A.2试剂 A. 2. 1 十六烷基