ICS 65.020.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3629—2020 马铃薯黑胫病菌和软腐病菌 PCR检测方法 Detection of pathgenic bactera for potato blackleg and soft rot by PCR method 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3629—2020 前 公共 口 标准 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：黑龙江省农业科学院马铃薯研究所、龙科雪川农业发展（克山)有限公司、农业农村 部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、中国农业大学、西南大学。 本标准主要起草人：魏琪、胡林双、董学志、白艳菊、吕典秋、王晓丹、彭亚清、闵凡祥、宿飞飞、范国权、 杨帅、王文重、郭梅、王绍鹏、刘振宇、高云飞、张抒、万书明、刘尚武、张威、邱彩玲、高艳玲、 1 NY/T3629—2020 马铃薯黑胫病菌和软腐病菌PCR检测方法 1范围 本标准规定了马铃薯黑腔胫病菌和软腐病菌的PCR检测方法，其致病菌株主要包括黑腐果胶杆菌 （Pectobacteriumatrosepticum，Pa）、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（P.carotovorumsubsp.carotovo rum，Pcc)和菊迪克氏菌（Dickeyachrysanthemi，Dch)3种。 本标准适用于马铃薯试管苗、原原种和田间马铃薯植株、块茎等组织中马铃薯黑胫病菌和软腐病菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必可少的。 G GB/T6682 分析实验室用水规格和试验 RE 3原理 大腐病的致病南基因组包含4500个基因，某此关 建区域在进化上较为保守， 其原理是：马铃 胫病和软 异性和唯 性，利用致病菌相应的特异性引物以基因组DN 为模板， 可代表该病原菌特 Taq DNA 聚 合酶的作用下 POP扩 增根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片 进行 黑胫病菌及软腐病 菌的目 4试剂与材料 以下所有试剂！ 除另有 6682 2 支水。 4.1植物基因组 4.2 Tag DNA 4.3 dNTP混合物 4.410XPCR缓冲 4.5 无水乙醇。 4.6 50XTAE电泳缓冲液 4.7 1×TAE电泳缓冲液 量取50XTAE电泳缓冲液20mL, 加水定容至1000mL 4.875%乙醇 量取无水乙醇75mL，加水定容至100mL。 4.9溴化乙锭溶液（10mg/mL）或GelRed核酸凝胶染料（溴化乙锭替代物） 称取溴化乙锭200mg，加水溶解，定容至20mL。 GelRed核酸凝胶染料按照商品推荐稀释浓度使用。 4.10 1.0%琼脂糖凝胶板 称取琼脂糖1.0g，加人1XTAE电泳缓冲液定容至100mL，微波炉中加热至琼脂糖融化，待溶液冷 却至50℃～60℃时，加溴化乙锭溶液或GelRed核酸凝胶染料5μL，摇匀，倒入制胶板中均匀铺板，凝固后 取下梳子，备用。 4.11引物缓冲液 用水将上、下游引物分别配制成工作浓度为10ng/μL的溶液。 1 NY/T3629—2020 4.122000bpDNA分子量标准物。 4.136×电泳上样缓冲液。 5主要仪器 5.1 PCR仪。 5.2台式高速离心机（离心力1180g～12470g）。 5.3电泳仪、水平电泳槽。 5.4凝胶成像仪。 ( 000~ 001 002～ 02 001 1 0～ g ～ 0) ' 5.6灭菌锅等。 6操作步骤 6.1对照的设立 试验分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照（即用等体积的水代替模板DNA作空白对照），在检测 过程中要同待测样品一同进行如下操作。 6.2样品制备 取马铃薯试管苗、茎、块茎维管束组织或发病组织0.1g，现用现取或4℃条件下保存（少于7d)。 6.3DNA提取 6.3.1植物组织样品DNA提取 试剂盒推荐步骤进行。 6.3.2菌株样品DNA提取 菌株水溶液经4000r/min离心后，弃掉上清液，留沉淀。后续操作参见植物基因组DNA提取试剂 盒推荐步骤进行。 6.4PCR扩增 6.4.1PCR扩增引物 上、下游引物为Pa、Pcc、Dch的特异性引物，见附录A。 6.4.2PCR反应体系 按表1顺序加入相应试剂（缩略语见附录B)，混匀，离心10s，使液体都沉降到PCR管底。 表1PCR扩增反应体系 试剂名称 每个反应中加人量，μL 水 16.3 10×PCR缓冲液（含Mg+） 2.5 dNTP混合物 4.0 上游引物（10μmol) 0. 5 下游引物（10μmol) 0.5 TaqDNA聚合酶（5U/μL) 0. 2 样品量（DNA） 1. 0 总体积 25. 0 6.4.3PCR反应程序 按表2列出的每对引物反应程序分别进行PCR扩增。 2 NY/T3629—2020 表2每对特异性引物的PCR扩增反应程序 引物名称 第一步 第二步 第三步 ECA1f 94℃,5min 循环36次：94℃，30s；62℃，45s；72℃，45s 72℃,7min ECA2r EXPCCF 94℃,5min 循环30次：94℃，60s；60℃，1min；72℃，2min 72℃,7min EXPCCR ADE1 94℃,5min 循环25次：94℃，60s；72℃，2min 72℃,7min ADE2 琼脂糖凝胶电泳 使用1.0%的琼脂糖凝胶板，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNA分子量标准物作 为分子量标记，进行凝胶电泳。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察，凝胶上是否出现预期的特 异性DNA条带，并拍摄记录。 8结果 8.1试验成立的条件 阳性对照检测到预期大小的特异性扩增条带，阴性对照和空白对照均没有检测到预期大小的目的条 带。若阴性对照、阳性对照和空白对照同时成立时，则表明试验有效，否则试验无效。 8.2阳性判定 待检样品若在690bp对应位置出现特异性条带，则判定样品为Pa阳性；待检样品若在550bp对应 位置出现特异性条带，则判定样品为Pcc阳性；待检样品若在420bp对应位置出现特异性条带，则判定 样品为Dch阳性。 8.3阴性判定 待检样品若在690bp对应位置未出现特异性条带，则判定样品为Pa阴性；待检样品若在550bp对 应位置未出现特异性条带，则判定样品为Pcc阴性；待检样品若在420bp对应位置未出现特异性条带， 则判定样品为Dch阴性。 NY/T3629—2020 附录A （规范性附录） 黑胫病和软腐病致病菌的特异性引物序列 黑胫病和软腐病致病菌的特异性引物序列见表A.1。 表A.1 黑胫病和软腐病致病菌的特异性引物序列 引物名称 引物序列（5 片段长度 病原菌名称 ECA1f CGGCATCAT AAAAAC ACG TCATCCACSA bp Pa ECA2rb GCACAC EXPCCF GAA CT CGC ACC CCYGAC CTTCT 50bp Pcc EXPCCRb GCCC TAA YTGCSTAC ADE1a CAG AAACCC Dch ADE2h CT TG CCG ATCAGG TG GTT TTG TCG TGC 注：a代表病原菌的 游引物Yb代表病原菌下游引物 引生 参考文献如下 SONIA N. HUMPH IRIS.GRE CAHILLOHN GE Bacterial Potato Pathogens Pectoba ickeya spp sing Conventional and Rgal Time PCREM eL PlantPathology: Techniques and P lsMeh inMolecuarHiolory.1302 R NY/T 3629—2020 附录B （规范性附录） 缩略 语 下列缩略语适用于本文件： Pa：黑腐果胶杆菌（Pectobacteriumatrosepticum）； Pcc：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum）； Dch：菊迪克氏菌（Dickeyachrysanthemi)； dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate)； PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）； TaqDNA聚合酶：嗜热菌DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）； DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)。 5