ICS65.020.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3625—2020 稻曲病抗性鉴定技术规程 Technical code of practice for identification of rice resistance to rice false smut[Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi] 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3625—2020 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准主要起草人：黄世文、王玲、刘连盟、郭荣、傅强、朱智伟。 I NY/T3625—2020 稻曲病抗性鉴定技术规程 1范围 本标准规定了水稻品种、材料对稻曲病抗性的鉴定方法和评价方法。 本标准适用于水稻品种、材料对稻曲病的抗性鉴定和抗性评价。 2规范性引用文件 GB4285农药安全使用标准。 GB4404.1粮食 未谷 GB/T6682 析实 验室用水规格 试验方法 GB/T8321(所有部分）农 药合理使用准贝 NY/T496 合理使用准则通则 NY/T511 公害食 水稻生产 支规材 L 3术语和定义 A 义通用 下列术语和定 本文件 U 3. 1 稻曲病 falsesmu rice 由稻绿核菌 有性世代为稻麦 角菌V noidea rens Villosiclava virens (Nakata)E. Tan &. 种水稻穗部真菌病害 期 正始显症，主要 危害谷粒。受害 谷粒内形成块状，逐渐膨大，形成比正常谷粒， 倍的病谷。发病初 期，稻谷颖壳缝合 乳白色薄膜包裹的菌块。随着病粒变大，乳白色包膜破裂呈现淡黄色、 黄色，后至墨绿色， 可产生黑色、扁平、 0粒基 上百粒。 3.2 分离物isolate 从发病部位通过人工培养、纯化、再接种和分离等方法获得病原物的培 物 3. 3 剑叶叶枕距flagleafpulvinusinterval 水稻剑叶从倒二叶的叶鞘中抽出后，剑叶叶枕与倒二叶叶枕之间的距离。剑叶叶枕高于倒二叶叶枕 时，为正叶枕距；剑叶叶枕低于倒二叶叶枕时，为负叶枕距。 3. 4 花粉内容充实期pollenfillingstage 花粉母细胞减数分裂完成后，四分体分散并随即变成小球形的花粉粒，花粉外壳逐渐形成，体积继续 增大，出现花粉发芽孔，花粉内容逐渐充实，直到内容物充满之前，为花粉内容充实期。此时内外纵向伸 长接近停止，横向则迅速增大。雄蕊和雌蕊迅速增长，柱头上依次出现羽状突起，而颖片退化 4试剂与材料 本标准所用试剂在未加说明时均采用分析纯试剂。实验室用水应符合GB/T6682中规定的三级水 NY/T3625—2020 要求。 4.1PSA培养基 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加入1000mL水，煮沸20min，纱布过滤，补水至1000mL，再加 人蔗糖20g和琼脂20g，搅拌均匀，高压灭菌（121℃，20min）。 4.2PSB培养基 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加入1000mL水，煮沸20min，纱布过滤，补水至1000mL，加入 燕糖20g，搅拌均匀，高压灭菌（121℃，20min）。 4.3WA培养基 琼脂20g，用水定容至1000mL，高压灭菌（121℃，20min）。 5仪器设备 5.1恒温培养箱 温度范围：0℃~50℃，温度波动：士1℃。 5.2光学显微镜 目镜：10×；物镜：10×、40×。 5.3超净工作台 洁净等级：100级@≥0.5μm，平均风速：0.25m/s~0.6m/s。 5.4高压灭菌锅 温度范围：0℃~135℃，灭菌时间范围：4min~120min，最高工作压力：0.22MPa~0.25MPa。 5.5振荡摇床 温度范围：0℃~50℃，温度波动：土1℃，振动频率：0r/min~300r/min，振动幅度：20mm。 5.6电子天平：感量0.01g。 5.7组织捣碎机：最高转数20000r/min。 5.8医用注射器：10mL。 6接种体制备 6.1病原菌分离、纯化与保存 6.1.1病原菌分离 以常规组织分离法从稻曲球上获得分离物。在超净工作台上切除稻曲球外层组织，将最内层的白色 部分切成约0.2cm×0.3cm的病组织块，先用75%乙醇溶液消毒15s，再用灭菌的三级水冲洗3次，无 菌滤纸吸干后置于PSA平板上，恒温培养箱中28℃培养。 6.1.2病原菌纯化 分离物培养7d以后，从生长的白色菌落边缘挑取少量菌丝转入新的PSB培养基上。在28℃下，150 r/min，振荡培养5d～7d后，用灭菌水配成每毫升含1X104个分生孢子的悬浮液。吸取100μL悬浮液 均匀涂布于WA培养基上，在超净工作台中吹干。28℃条件下培养至分生孢子萌发，在光学显微镜下镜 检，挑取萌发的单个分生孢子置于新的PSA培养基上，28℃恒温培养，并保存备用。 6.1.3病原菌保存 将待保存的菌株接种在PSA培养基上，周围摆放灭菌的滤纸片，28℃恒温培养，待菌丝长过滤纸片， 用镊子将滤纸片揭下，装入灭菌的硫酸纸袋，置于装有硅胶的容器中干燥，再将硫酸纸袋密封，并装入灭菌 的牛皮纸袋，于一20℃低温保存。 6.2病原菌鉴定 依据病原菌形态和部分基因序列对接种用的菌株进行鉴定，见附录A。 6.3接种体制备 2 NY/T3625—2020 6.3.1接种体选择 接种应采用当地致病力较强的稻曲病菌株。 6.3.2接种体繁殖 将稻曲病菌株移植到PSA培养基的正中央，置于恒温培养箱28℃培养10d。在无菌条件下用直径 5mm的灭菌打孔器，自菌落边缘切取菌饼3块，接种于100mL的PSB液体培养基中。在黑暗条件下， 28℃，150r/min，振荡培养5d～7d后，获得大量菌丝和薄壁分生孢子。将振荡培养液倒入组织捣碎机， 高速打碎菌丝，形成菌丝片段与薄壁分生孢子的混合液，用灭菌的PSB培养基调整每毫升含5X105个分 生孢子，作为接种物以备用。 7稻曲病抗性鉴定 7.1 鉴定室 PUBI 鉴定室应具备人工调节温度 7.2鉴定材料的种植 7.2.1种子质量 鉴定材料种子 40 常规稻或杂交稻- 一级种标准 不应带检疫性病虫。 7.2.2对照品种 鉴定时设附 绿 中技 病和感疗 在相应生 型区内选 先用 当地生产上具有 代表性的已知抗性品种为对 EAF 7.2.3鉴定设计 A 鉴定材料随机排型或 份鉴定材料设1组已知抗病 口感病对照品种。每份鉴 顶序排列，每50份～100 定材料重复3 复 CH 次 林。 选择饱满度 致的鉴 冲洗后 放入垫有两层 湿润滤纸的培养皿 中然后 30℃恒温培养箱中催芽待胚根长至 cm时 择芽+ 选 致的种子播于 表层覆 直径为40cm、高度 每盆播种3粒健康饱满的萌发种子 cm。在18℃~ NTE 28℃的自然光照 苗，幼苗应 7.2.5鉴定材料管理 土壤肥力水平和 5117的要求。农药 使用应符合GB4285、C 18321（所有部分）及标签的要求鉴定材料 全生食 期内不使用杀菌剂，接种 前后避免施用任何药剂。 7.3接种 7.3.1接种时期 接种时期为水稻剑叶叶枕距2cm～ 8cm（该时期为幼穗发育的花粉内容充实期），在16：00~18：00 接种。 7.3.2接种方法 采用注射接种方法。将孢子菌丝混合液注射入穗苞中部，直至穗苞中充满菌液，并从穗尖溢出为宜。 每份鉴定材料重复3次，每一重复接种15株，每株1个穗子，且接种稻穗生育进程基本一致。 7.3.3接种后管理 接种后将水稻置于22℃～25℃的可控温室中，相对湿度95%以上，12h/12h光暗交替条件下培养 3d后，置于温度为25℃28℃、相对湿度90%的可控温室中继续培养。 7.4病情调查 7.4.1调查时间 水稻蜡熟期转黄熟期。 3 NY/T3625—2020 7.4.2调查与记载 对每份鉴定材料病害发生情况进行调查，记录发病最重的10株单穗病粒数，作为鉴定材料的病情级 别，原始数据记载参见附录C的表C.1。 7.4.3稻曲病病情级别划分 稻曲病病情级别及其相对应的症状描述见表1。 表1稻曲病病情级别的划分 病情级别 单穗病粒数 0 穗子上无病粒 1 每穗病粒数1个 3 每穗病粒数2个～4个 5 每穗病粒数5个~8个 7 每穗病粒数9个~15个 9 每穗病粒数≥16个 7. 5 5病情记载 根据病情症状描述，对每个接种稻穗进行调查，记载单株病情级别，并计算每份鉴定材料的病情指数 (DI)。病情指数按式(1)计算。 Z(Bi X Bd) DI : X100 MXMd (1) 式中： DI 病情指数； Bi 各级严重度病穗数，单位为穗； Bd 各级严重度代表值； M 调查总穗数，单位为穗； Md- 一严重度最高级代表值（此处为9）。 7.6抗病性评价 7.6.1抗病性评价标准 依据鉴定材料3次重复的病情指数(DI)的平均值确定其抗病性水平，划分标准见表2。 表2水稻对稻曲病抗性的评价标准 病情指数(DI) 抗性评价 DI = 0 免疫(I) 0.0<DI≤5.0 高抗(HR) 5.0<DI≤10.0 抗病(R) 10.0<DI≤20.0 中抗(MR) 20.0<DI≤40.0 中感(MS) 40.0<DI≤60.0 感病(S) 60.0<DI≤100.0 高感(HS) 7.6.2鉴定有效性判别 当设置的感病对照品种病情指数（DI)达到40以上时，判定该批次稻曲病抗性鉴定有效。 7.6.3重复鉴定 初次鉴定中表现为抗、中抗、中感的材料，需用相同的病原菌对其抗病性进行至少1年的重复鉴定。 当年度间