ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3621—2020 油菜根肿病抗性鉴定技术规程 Technical code of practice for evaluation of clubroot disease resistance in oilseedrape 2020-07-27发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3621—2020 M 食典通 X 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、安徽省农业科学院作物研究所、沈阳农业大学。 本标准主要起草人：任莉、伍晓明、方小平、费维新、朴钟云、陈凤祥。 1 NY/T3621—2020 油菜根肿病抗性鉴定技术规程 1范围 本标准规定了油菜根肿病抗性鉴定的鉴定方法和抗性评价标准。 本标准适用于油菜根肿病的抗性评价。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本） GB/T19557.14 NNG 3术语和定义 下列术语和定义适 用于本文 3. 1 鉴 抗病性自然 侵染 esistance identification through natural pathogen 的口种 田间病原物 白 然诱发 而评定试验材料的抗 程度 或发病程度 作物抗病性鉴定 RA ARC 方法。 3. 2 人工接种鉴定 resjsta nce identification through artificial inoculation 然发病 创造适宜的条件让植 殊发病而评定试验材料的抗 感芮程 在室内模拟自 CUL 4抗性鉴定 4. 1 感病对照品 邦 以常规栽培油卖 照品种 4. 2 2田间自然侵染 4.2.1试验地点的选 按试验的大区域（ 长江上、 下游选择至少个根肿病重发的试验 根肿病的症状识别 参见附录A。要求每克士 上壤中根肿菌休眠孢 包子含量高于1.0×106个，根肿 病发病率50%以上。根 肿病休眠孢子的定量方法参 参见附录B。试验前 年在试验地种植感病品 种“米”字9点取样调查病 株分布均匀性（每点病株率>50 “米”字9点取样的具体方法 为以标准地的正中间为核心，在 离标准地四边4步～10步远的各处按照“米” 4.2.2油菜材料的田间排布和管理 试验设计和田间管理按GB/T19557.14的规定进行，每个材料种植12行，每行20株，重复不少于3 次。全部农事操作应一致。 4.2.3调查时间 分别在油菜出苗后45d和初花期各进行1次病害调查。 4.2.4调查方法 调查时将植株连根拔起，根据表1的分级标准调查根肿病发病程度。调查不少于3个重复，各重复大 于50株。结果记入附录C中的表C.1。 1 NY/T3621—2020 表1油菜根肿病严重度分级标准(4级) 病级 病情 0 根系正常，无症状 1 1/3以下侧根形成直径0.5cm以下小肿瘤，主根无肿瘤 2 1/3～2/3侧根形成肿瘤，或主根上肿瘤直径或长度为茎基直径的3倍以下 3 2/3以上侧根形成肿瘤，主根肿瘤明显，肿瘤直径或长度为茎基直径的3倍以上，或肿瘤溃烂 4.3人工接种鉴定 4.3.1接种体悬浮液的制备 从田间自然侵染鉴定的试验田收集病根并提取病原。在显微镜下用血球计数板测量和计算休眠孢子 （接种体)浓度，用pH6.0的磷酸盐缓冲液调整休眠孢子浓度为1.0X107个/mL。具体方法见附录B。 4.3.2接种方法 将接种体悬浮液与灭菌营养土（草炭土和蛭石等体积混合)以1/10(V/W)的比例混匀，使每克营养土 中休眠孢子浓度为1.0×10°个。将制备好的菌土装人直径大于15cm的营养钵中，每钵装土至营养钵4/5 高度处。油菜种子经55℃温水浸种15min后直播于菌土中。每个待鉴定油菜材料和感病对照播种各9 钵，每钵定植15株油菜苗。每份材料3钵为1个重复，重复3次。 4.3.3接种后的管理 接种后将营养钵置于鉴定室内培养，保持温度20℃～25℃，昼夜14h光照，并保持土壤湿润。 4.3.4调查时间 出苗后45d进行病害调查。 4.3.5调查方法 将所有植株连根拔起，冲洗干净后分级调查，结果计入表C.1。 4.4发病率和病情指数计算 发病率按式(1)计算。 D P: X100 (1) N 式中： P一根肿病发病率，单位为百分号（%)； D—发病植株数，单位为株； 调查总株数，单位为株。 病情指数按式(2)计算。 Z(s Xn) DI= X100 NXS (2) 式中： DI 根肿病病情指数； 各病情级别（如数值0～3)； n 对应各病情级别的株数，单位为株； S 最高病情级别。本标准中S=3。 5抗性评价标准 根据鉴定材料的病情指数确定试验材料对根肿病的抗性等级，划分标准见表2。当感病对照品种的 DI>50为试验有效。每个试验材料以发病最重的重复视为最终结果。田间自然侵染鉴定时，在确定试 验有效的情况下，苗期和初花期鉴定结果以发病最重的结果视为最终鉴定结果。 当某一特定材料的自然侵染鉴定苗期的鉴定结果和人工接种鉴定结果不一致时，若等级相差一级（如 抗、感），以人工接种鉴定结果为准；若等级相差一级以上（如高抗、感），则视为鉴定结果无效，需要重新鉴定。 2 NY/T3621—2020 表2 油菜对根肿病抗性评价标准 病情指数(DI) 抗性等级 DI= 0 免疫(I) 0<DI<10 高抗(HR) 10<DI≤30 抗(R) 30<DI≤50 感(S) DI>50 高感(HS) 鉴定材料病残体处理 调查结束后，将带根肿病苗（病根)集中用生石灰处理后深埋。 7报告 7.1结果与分析 7.1.1在分析试验数据有效性的基础上，以各试验组别为单位，评价各材料的抗性表现，列出相应的数据 表。油菜根肿病抗性鉴定结果统计表见表C.2，最终鉴定结果评价表见表C.3。 7.1.2总体上将该年度抗性鉴定的结果进行简要描述；分析该年度抗性鉴定结果的准确性、精确性和有 效性；最后对试验中存在的问题、需要注意的事项和改进的要求作出分析报告。 3 NY/T3621—2020 附录A (资料性附录） 油菜根肿病基本信息 A.1病原菌 根据Ainsworth(1973)的分类系统，油菜根肿病病原菌为芸基根肿菌（Plasmodiophora brassicae Wor.），属于原生动物界丝足虫门根肿菌纲 A.2 病害症状 染根肿菌后 初期地上 大，部分叶片会呈现浅绿色至 淡黄色。后期随着根肿菌的侵来，地 表现出缺水症状， 在白天 出现萎症状，早晚恢复 正常，植株生长缓慢、 矮 小，严重时全株枯死 根肿病最典型的症状是在根部出现大小不等的肿瘤，肿瘤/般为纺锤形 棍棒形等形状。一般 主根肿瘤大而少 ，侧根肿瘤多而小，初期肿瘤表面光滑，后期常爱生龟裂、粗粒 而使肿瘤溃烂， 起 整个油 根系腐烂 NY/T3621—2020 附录B （规范性附录） 根肿菌休眠孢子提取与定量方法 B.1病根中根肿菌休眠孢子提取和定量方法 B.1.1孢子提取方法 根瘤用流水洗净泥土后加适量蒸馏水，用搅拌机充分搅碎。浑浊液用4层纱布过滤后，2500g离心 5min，重复3次。每次离心后弃上清液，沉淀用蒸馏水重新悬浮。最后一次离心获得的沉淀用适量蒸馏 水或pH6.0磷酸盐缓冲液悬浮。获得的休眠孢子悬浮液测量孢子浓度后保存于4℃冰箱备用。 B.1.2孢子计数方法 取干燥洁净的血球计数板，在中间计数区盖上盖玻片。孢子悬浮液适当稀释后，摇匀，用移液器吸取 少量悬浮液，从血球计数板计数区两边的沟槽内缓慢注人计数区，用吸水纸吸去多余的孢子悬浮液。静置 片刻后，将血球计数板置于显微镜载物台上。先在低倍镜下找到计数区（双线区），再切换到高倍镜下计 数。共统计5个大格（80个小格)的休眠孢子数量，即左上、左下、右上、右下和正中间。检测的休眠孢子 浓度计数公式为：休眠孢子浓度（个/mL）=5个大格的休眠孢子总数/2×10°×稀释倍数。 B.2磷酸盐缓冲液(pH6.0)的配置方法 a）配制0.2mol/LNazHPO4（A液）：称取NazHPO4·2H2O85.61g，溶解后定容至1000mL； b）配制0.2mol/LNaHzPO,（B液）：称取NaHzPO42HzO31.21g，溶解后定容至1000mL。 取A液12.3mL、B液87.7mL，混匀，获得pH6.0的磷酸盐缓冲液。 B.3土壤中根肿菌休眠孢子定量方法 用土壤取样器取20g以上耕作层土壤（0cm～20cm），采用土壤DNA提取试剂盒（如MoBioPower SoilIsolation试剂盒），根据试剂盒建议的方法提取土壤中的根肿菌DNA。采用荧光定量PCR检测根肿 菌的含量，所用的引物序列如下： -PbF:5'-AAACAACGAGTCAGCTTGAATGC-3; —PbR:5'-TTCGCGCACAAGCACTTG-3°。 5